第三章高效液相色谱法.pptVIP

高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 一、HPLC与GC对比 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。 3．操作条件区别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 二、HPLC的特点和实际应用 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2）涡流扩散项及其影响 3）传质阻力项及其影响 1． 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相dp≤10μm）,首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC） （ steric exclusion chromatography 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等 固定相：固定相粒径（10μm） 4 竞争吸附平衡 Xm+nSa=Xa+nSm X 溶质分子 S 溶剂分子 如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子就少。 分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附能力强，保留值就大。 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液——极性→NLLC 固定液——非极性→RLLC 3．正相色谱——固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱——固定液极性 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分 （一）常规化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2．特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱 （二）正相键合相色谱 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱,极性大的组分后出柱 （三）反相键合相固定相 1．分离机制：疏溶剂理论 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS