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细胞生物学综合性实验 动物骨髓细胞染色体标本的制备及NOR的观察 骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。 细胞生物学综合性实验 实验目的 掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术 观察染色体的数目以及形态特征 熟悉银染法显示动物细胞NOR的原理和方法，并了解NOR在细胞中分布情况 实验原理 经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。 银染法可以显示中期染色体上的核仁组织区（NOR）。当NOR在间期转录时，产生一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留至中期并能将染液中的银离子还原为金属银而显现为黑色。所以银染法可在中期染色体上显示具有转录活性的NOR数目。而且，染色的深黑程度，还可以反应出基因的活性高低。 实验材料 小白鼠或青蛙 实验仪器、用具 天平 离心机 温箱（或水浴锅） 显微镜 酒精灯 注射器（1ml） 解剖盘 解剖剪 刀片 离心管 吸管 烧杯 冰冻载玻片 试剂1 Carnoy固定液（现用现配） 甲醇：冰醋酸=3：1 生理盐水 0.1%秋水仙素溶液 用生理盐水配制 1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） Giemsa染液 试剂2 50%硝酸银溶液 氨银溶液： 4g硝酸银溶于5ml蒸馏水，再加入5ml浓氨水 3%甲醛溶液：3ml36%甲醛液，加蒸馏水97ml，用4g无水醋酸钠调节pH7，4℃保存。使用前用甲酸调pH4.5 动物染色体制备方法和步骤 秋水仙素处理 实验前3~4h，按动物每克体重2~4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素 收集骨髓细胞 处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉，切开股骨两端，用吸有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。 将收集的骨髓细胞于1000rpm离心10min 动物染色体制备方法和步骤 低渗处理 离心后加入600ul蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，置37℃低渗20min 固定 沿管壁逐滴加入固定液600ul，吹打成悬液，室温固定20min，离心。重复此操作一次。最后用500ul固定液将沉淀悬浮。 动物染色体制备方法和步骤 滴片 用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥 Giemsa染液染色30min，镜检 注意事项 低渗处理是实验成败的关键 处理和操作过程中注意要有利于细胞完整和染色体的伸展、分散 作业 绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图 指出染色体数目（2n） NOR的显示实验步骤 快速银染法(可选）： 在染色体标本上滴加含1%甲酸的2%明胶水溶液3滴，再加50%硝酸银3滴，混合后盖上盖片，将标本置于60℃恒温台上处理至液体为棕黄色为止，自来水冲洗，空气干燥，镜检。 NOR的显示实验步骤 氨银染色法（建议） 标本上滴加4-8滴50%硝酸银溶液，立即覆以盖玻片，放入潮湿密封的培养皿中，37℃温箱中24-48h，或50℃2-5h 流水冲去盖玻片，蒸馏水洗2次，室温晾干 加4d氨银溶液和4d3%甲醛溶液（pH4.5）于染色体标本上，立即覆以盖玻片，室温12min 流水冲去盖玻片，蒸馏水洗净 2%Giemsa染色10-15min 水洗，空气干燥，镜检。 实验结果 若染色适中，间期核及染色体为金黄色，油镜观察，可在某些染色体上看到成对的黑色小点，此即为银染NOR（Ag- NOR）。 若整张片子色淡，间期核及染色体都不易看清，为染色时间不足，在未滴过香柏油的情况下，可重新续染。 若染色时间偏长，则染色体为棕色，此时，仍可看到黑色的NOR，只是NOR与染色体间的反差较低。染色严重过度时，整张片子都布满黑色沉淀，这样的标本一般都丢弃不用。若标本珍贵，也可采用特殊方法褪色后重新染色。 注意事项 硝酸银现配现用 银染液可使衣服、皮肤染色，小心操作 3%甲醛工作液pH必须为4.5 作 业 在油镜下绘制一中期分裂相图（Ag-NOR的位置、数目和形态）。 思考题 分析你做的标本的优劣，并分析要使实验中的成功应注意哪些问题