细菌α淀粉酶产生菌种筛选.pptVIP

细菌α-淀粉酶产生菌种筛选 一．实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固所学的微生物学实验技术。 二. 实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。 1、采样：即采集含菌的样品 1）研究所筛选的微生物得可能分布区域。 2）土壤是微生物的大本营，所以一般采集土样。 3）土壤中，数量上细菌放线菌霉菌酵母菌。 4) 不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多；果实、树叶表面酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称富集培养） 增殖培养就是在所采集的含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于采用稀释分离法分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种只是选种工作的第一步。所分离的纯种是否具有生产上要求的优良性能，还必须进行性能测定，根据性能高低进行取舍。 性能测定的方法 1）初筛：一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。 例如要筛选淀粉酶产生菌，可以在稀释分离时使用选择培养基——含淀粉的培养基，经培养后通过测定透明圈与菌落直径的比值来衡量淀粉酶活力的高低。 三．实验材料 1、材料：小铁铲和无菌纸或袋。无菌水三角瓶（300mL的瓶装水至99mL，内有玻璃珠若干）；无菌吸管（1mL，5 mL等）；无菌水试管（每支4.5mL水）；无菌培养皿； 2、培养基 1）分离培养基（w/v）：蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；牛肉膏 0.5%；可溶性淀粉 0.2%；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调匀。 2）肉膏蛋白胨培养基（w/v）：肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%, pH7.0-7.2 3）麸曲培养基：麸皮7克； 玉米面 1克； (NH4)2SO4 0.04克 (4%(NH4)2SO4加1mL)； NaOH 0.08克(8%NaOH加lmL)；水10mL，混合均匀，装入250-300mL三角瓶中，15磅灭菌30分钟。 3.试剂： 1）Lugol氏碘液：碘1克，碘化钾2克，水300毫升。 配制时先将碘化钾溶于5-10毫升水中，再加入碘，溶解后定容。 2）碘原液： 碘 2.2%； 碘化钾 4.4%； 加水定容。 3）比色稀碘液：碘原液2mL，加碘化钾20g，定容至500mL。现配现用。 4）0.2%可溶性淀粉液（w/v）：称取0.2克可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏水中，继续煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。 5）pH6.0磷酸氢二钠--柠檬酸缓冲液：Na2HPO4·12H20 11.31克，柠檬酸 2.02克，加水定容至250mL。 四．实验方法 ④碘液检查：培养24小时后，取出平板，无菌操作向皿中注入1滴Lugol氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉。 ⑤菌种纯化：无菌操作从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜面上，并进行2-3次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。 2、麸曲培养 取纯化菌落斜面中加入5mL无菌水制成菌悬液，取1mL接种至麸曲培养基中，搅匀后，36-37℃培养24小时。 3、酶活测定 ①制备酶液：在已成熟的夫曲三角瓶中，加水100mL，搅匀，置30℃水浴30分钟，用脱脂棉过滤，滤液即细菌α-淀粉酶液。 ② 酶活测定：在三角瓶中，加入0.2%可溶性淀粉溶液2mL，缓冲液0.5mL，在60℃水浴中10分钟平衡温度，加入3mL酶液，充分混匀，即刻记时，定时取出一滴反应液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐渐变为红棕色，即为反应终点，记录时间（t），单位为分钟。 ③酶活力单位的计算 淀粉酶活力单位的定义：1克或1mL酶制剂或酶液于60℃，在1小时内液化可溶性淀粉的克数 [克/克(或毫升)·小时]。 淀粉酶活力单位=（60/t）×2×0.2%×f/3（f/t） 式中f是酶的稀释倍数