实用细胞培养技术1.ppt

实用细胞培养技术 袁广卿  ◆ 在细胞培养中注意的一些问题 ◆ 细胞培养的实验程序 ◆ 细胞的复苏 ◆ 细胞的计数 ◆ 细胞(贴壁)的传代培养? ◆ 细胞的冻存 ◆ 悬浮细胞的培养方法 在细胞培养中注意的一些问题 环 境 由于体外培养细胞没有抗感染能力，即便使用设备完善的实验 室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而， 每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠，特别是实验环境更为 重要。 1. 培养室和超净台的消毒 无菌培养室每天都要用0.2％的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面 一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30－50min，超净工作台台 面每次实验前要用 75％酒精擦洗，然后紫外线消毒 30 min。在工 作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时 工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒 效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75％ 酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。 2. 培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算 要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误 后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒。这样 可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性， 并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。 首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜，以中和其碱 性物质。最后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三蒸水 漂洗2遍，烘干备用。 (2)塑料器皿:塑料器皿经冲洗干净后，晾干，用2％NaOH浸泡过 夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸 馏水漂洗3遍，三蒸水漂洗2遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸 液,用2％NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干 （600C以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装膜时 注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损， 安装好膜后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒内（或用牛皮纸包装） 外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋 旋紧；胶塞的处理：按常规冲洗干净烘干后，用2％氢氧化钠溶液 煮沸30分钟（用过的胶塞要置入水中浸泡，再用沸水处理30钟）， 自来水洗净，烘干然后再泡入1％稀盐酸液中30分钟，用自来水彻 底冲洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三蒸漂洗2遍，烘干备用。 2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落人灰尘及 消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、 消毒日期等。 3.消毒: 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件 下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除） 和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。 (1)消毒灭菌的方法 : ★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线。射线、过滤 、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物. ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 橡胶和塑料用品 ：如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min ★紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌 椅等消毒。时间为30分钟－2小时左右。 ★过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成 培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。 4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ，可 高压除菌。 （3）消化液 : ★ 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左右。 需过滤除菌。 ★ EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡 盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 ★胰蛋白酶EDTA－Na2:胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率， 但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 ★胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细 胞与胶原成分分离而不受损害。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原 酶的消化作用，因而可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作 简便同时提高细胞成活