实验1蔗糖酶的提取.ppt

* * 蔗糖酶的提取 实验一 细胞破碎的常用方法 机械法 非机械法 液体剪切法 固体剪切法 超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法 压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 一、实验目的和要求 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。 由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉 8g/组(3～4人） 2、实验试剂 ⑴ 石英砂， ⑵ 95% 乙醇(-20℃）， ⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 1、电子天平（称量样品）； 2、高速冷冻离心机； 3、制冰机； 4、冰箱(－20℃) ； 5、托盘天平（离心管平衡用）； 6、恒温水浴箱（50℃）； 7、50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）； 8、1.5ml 、 7ml离心管（留样品Ⅰ、 Ⅱ 、Ⅲ用）及离心管架 ； 9、研砵（每组一套）。 五、实验操作方法和步骤 分组操作：每组3～4人。 1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉8g，约2.5g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积40ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内继续研磨10分钟，使呈糊状液体，将其转移到2支50ml离心管中，平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液，量取并记录总体积；另留存1ml上清液置小离心管中（贴上标签—样品I ） ，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS分析。 2、热处理： 将上清液迅速放入50℃恒温水浴箱中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌。保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后， 4℃，12000r/min离心15分钟，收集上清液，量取并记录总体积；另留存1ml上清液置小离心管中（贴上标签—样品Ⅱ），放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml离心管中，平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验——实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。 六、实验结果分析讨论 七、思考题 本实验在从干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中具体运用了哪些方法？你认为还有哪些方法可以运用？说说你的设想。