实验6-血红蛋白凝胶柱层析(恢复).ppt

血红蛋白凝胶柱层析 实验6 1.学习蛋白质大分子的分离纯化原理和方法 2.学习凝胶柱层析的操作技术 实验目的 实验原理 生物实验中经常对不同生物大分子进行分离纯化，以便对他们作进一步的研究。对生物大分子进行分离纯化的基本原理主要是利用它们之间各种理化性质的差异，如：利用分子表面荷电状态的不同发展成熟的电泳技术；根据不同分子对介质吸附性不同而建立的吸附层析，疏水层析等技术；利用生物大分子特异亲和的特性建立亲和层析技术及生物芯片检测技术。 凝胶层析是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化。该方法是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。 凝胶层析所用的基质(凝胶)是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这些物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分化合物则不能排阻，让其在筛孔中自由扩散、渗透。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 无法载入该图片。 凝胶球可以制作成不同的孔径，用于分离不同大小的蛋白质。 凝胶过滤不仅常用作物质的分离，还可以根据需要用某种试剂非常方便的处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，再与过量的试剂分开。 本实验首先在层析柱中加入含有FeSO4的溶液，使形成一个还原区带。当血红蛋白样品流经还原区带时，还原剂FeSO4与血红蛋白发生氧化还原反应，使血红蛋白发生类似动脉血（氧合血红蛋白，鲜红）与静脉血（还原型血红蛋白，暗红）之间的颜色变化，层析中可动态观察。 本实验的待分离样品是血红蛋白和铁氰化钾的混合溶液。血红蛋白溶液外观颜色为红色，而铁氰化钾是相对分子质量很低的无机小分子，溶液外观为黄色。层析过程中因铁氰化钾相对分子质量小，在层析柱中呈现黄色带远远落在血红蛋白后面。 材料：抗凝血（鸡血，以6：1比例加入2.5%柠檬酸钠溶液，置于4℃冰箱中保存） 试剂：20mmol/L磷酸缓冲夜（pH7.0） 40mmol/L FeSO4(用时现配) 0.2mmol/L Na2HPO4 80mmol/L Na2H2EDTA 药品：固体铁氰化钾，葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） 仪器及其它：层析柱10*20cm，50ml烧杯，3ml刻度 滴管，滤纸片 ，玻璃试管 实验用品 1 葡聚糖凝胶的预处理 取3g葡聚糖凝胶干粉，浸泡于50ml蒸馏水中充分溶胀（室温，24h），然后反复倾斜去除表面悬浮颗粒，再加入pH7.0 磷酸缓冲夜沸水浴中2-3h去除颗粒内部空气，最后加入pH7.0磷酸缓冲液浸泡过夜备用。 实验步骤 2 装柱及平衡 将层析柱组装好垂直固定在铁架台上。 将层析柱底的出水关闭，向柱中加入约2cm高度的磷酸缓冲液，把3g(约30 ml混悬液）溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒边轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。 自然沉降20min，装柱高度不少于8cm，最后放入略小于层析柱内径的圆型滤纸片，以保护柱床面加样时被冲起。加入磷酸缓冲液，保持液面3-4 cm高度，每秒1/2滴流出速度洗脱平衡柱床10 min。 3 血红蛋白样品制备 取1ml抗凝血于小烧杯中，加入10ml 20 mmol/L、pH7.0 的磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/mL（全班共享）。 4 层析柱还原层的形成 吸管取1ml 40mM FeSO4于小烧杯中，加入1mL 0.2 mmol/L Na2HPO4-1ml80mmol/L Na2H2EDTA 混合液搅拌均匀。控制层析柱上缓冲液几乎完全进入凝胶时，止体。速取该混合液0.5ml，小心加入层析柱中，控制流速，使混合液缓缓进入柱床，至完全；加入0.5ml缓冲液，同法操作。 5 上样 待柱中的磷酸缓冲液进入柱床后，止流，加入前面配制好的血红蛋白样品0.5ml，打开液流使