生物化学5-1课件.pptVIP

蛋白质 蛋白质的分类和性质 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的结构 蛋白质的分离和纯化 蛋白质的分离 蛋白质的纯化 重点掌握—— 蛋白质分离纯化的基本方法 蛋白质的纯化 1.根据分子量大小不同 透析 离心沉降 凝胶色谱 2.利用溶解度不同 等电点沉淀 盐析 有机溶剂沉淀 根据分子量大小不同- 2. 离心沉降 （最常用的蛋白质分离方法） 原理： 当物体围绕一中心做圆周运动时，运动物体受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体受到的离心力越大。在相同的转速下，容器中不同大小的高分子溶质会以不同速率沉降。经过一定时间的离心操作，就可实现不同物质的分离。 2. 离心沉降 （高速50,000rpm,超速 60,000rpm) 控制不同的离心速度，可以分离蛋白质 思考题 以下蛋白质混合物用Sephadex G-200凝胶色谱分离，将以何顺序被分别洗脱下来：肌红蛋白（相对分子质量=16 000），过氧化氢酶（相对分子质量=500 000），细胞色素C（相对分子质量=12 000），胰凝乳蛋白酶原（相对分子质量=26 000），血清白蛋白（相对分子质量=65 000）。 注: Sephadex G-200颗粒孔径排出相对分子质量高限为200 000） 答案 过氧化氢酶（相对分子质量=500 000） 血清白蛋白（相对分子质量=65 000） 胰凝乳蛋白酶原（相对分子质量=26 000） 肌红蛋白（相对分子质量=16 000） 细胞色素C（相对分子质量=12 000） 离子交换色谱 pHpI 正电荷，pHpI 负电荷 差异越大，带电荷越多，与树脂结合能力越强。 洗脱：以带正电荷的蛋白质为例，用NaCl梯度洗脱，通过Na+离子的交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质分离。 思考题 含有乳清蛋白(pI=4.6),?乳球蛋白(pI=5.2),胰凝乳蛋白酶原(pI=9.5)的溶液用二乙胺基乙基纤维素(DEAE-纤维素)pH为5.4时的层析柱分离.然后用pH为5.4的缓冲液洗脱,缓冲液中盐浓度逐步增加,预测三种待分离蛋白质组分的洗脱顺序 答案 在pH为5.4时,DEAE-纤维素带正电荷,胰胰凝乳蛋白酶原(pI=9.5)带正电荷,不与DEAE-纤维素结合,先流出. ?乳球蛋白(pI=5.2)带少量负电荷,与DEAE-纤维素结合力弱,随着缓冲液中盐浓度增加,被置换下来 乳清蛋白(pI=4.6)带大量负电荷,与DEAE-纤维素结合紧密,只有当缓冲液中盐浓度很高时才可被洗脱下来.或者降低缓冲液pH值,使乳清蛋白所带负电荷减少,才可被洗脱下来. 思考题（p82.7) 将门冬氨酸(Asp,pI=2.98),甘氨酸(Gly, pI=5.97)，苏氨酸(Thr,pI=6.53),亮氨酸(Leu,pI=5.98)，赖氨酸(Lys, pI=9.74)溶于pH3.0柠檬酸缓冲液中，加到用同样缓冲液平衡的Dowex-50阳离子交换树脂柱上。然后用缓冲液洗柱，并分部收集。这五种氨基酸将以什么顺序从柱上洗脱下来？ 思考题 答：门冬氨酸(Asp,pI=2.98),苏氨酸(Thr,pI=6.53), 甘氨酸(Gly, pI=5.97),亮氨酸(Leu,pI=5.98),赖氨酸(Lys, pI=9.74) 考虑1.带电荷情况；2.测链基团的极性 苏氨酸中带有-OH 亮氨酸比甘氨酸非极性强 增加缓冲液pH值或离子强度后，Lys才能洗脱下来 根据电性质不同分离-电泳 外电场作用下，带电粒子向着与其电性相反的电极移动，这种现象叫作电泳。 电泳分离蛋白质原理： 不同蛋白质相对分子质量不同，所带电荷不同，蛋白质在电场中移动速率不同。 思考题 在电场中，下列蛋白质将向那个方向移动（阳极、阴极或固定不动）？ (a)卵清蛋白 (pI=4.6)，溶液pH5.0 (b)pH为5.0及7.0时的?-乳球蛋白(pI=5.2) 思考题答： (a)卵清蛋白，pH5.0pI, 蛋白质带负电荷，向阳极移动 (b) ?-乳球蛋白 pH5.0pI, 蛋白质带正电荷，向阴极移动 pH7.0pI, 蛋白质带负电荷，向阳极移动 思考 血红蛋白A的等电点pI=6.9,变异血红蛋白M中?链6位的Glu(谷)残基取代了正常血红蛋白A该位置上的Val(缬)残基。这种取代使血红蛋白M在pH=7.5时的电泳行为发生怎样的改变？ 答： pH=7.5时血红蛋白A带负电， Glu残基取代后使负电荷增加，向阳极泳动速度加快 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS） SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，蛋白质分子带有足够的负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，Eq值