生物制品分析课件.pptVIP

【基本要求】 特 点 毛细管电泳的基本原理 电泳分离的基础 毛细管电泳装置 常用的定量分析方法及应用 理化分析法 生化分析法 生物检定法 理化分析法 化学分析方法 电化学分析法 光谱分析法 色谱分析法 重量法 容量分析法 重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重量测定所含成分的含量的方法。 提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶剂进行测定的方法。 挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将其转化成挥发性物质来进行测定的方法。 沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定沉淀的重量来计算含量的方法。 比色法 利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan 硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在525 nm处有最大吸收。 光谱分析方法 具体试验操作： 1、制备对照品溶液－氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液－硫酸软骨素 3、反应和测定－缩合反应和比色测定 A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数 以氨基葡萄糖计≥24.0％ 高效液相色谱法 反相高效液相色谱法 RP-HPLC Reversed-phase high-performance liquid chromatography 高效离子交换色谱法 HPIEC High-performance Ion-exchange chromatography 高效凝胶过滤色谱法 HPGFC High-performance Gel-filter chromatography 反相高效液相色谱法 基本原理：利用ODS或C18等极性较小的键合硅胶为填料，以极性较大的methanol-water、CH3CN-H2O为流动相，根据样品在固定相和流动相中的不同保留行为而实现高效分离的一种方法。 可以应用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作为检测器，分离化合物范围广泛。 Determination of AAs by RP-HPLC with pre-column derivation technique Chromatographic conditions Column (Beckman Ultrasphere RP-C18 (250 ×4.6 mm, I.D., 5μm) Mobile-phase: 0.05% TFA (A) and 乙腈-异丙醇（4：1），梯度洗脱。 Flow rate:1.2 ml/min Column temperature :48℃ Detector:FD 280 nm/430 nm 测定样品的制备：取肽样品－置于水解管中－加内标－加盐酸－水解－干燥－溶解（NaHCO3和EDTA)－加反应液（丹酰氯）－再加NaOH水解丹酰氯－进样分析 生白能的RP-HPLC测定 色谱条件 色谱柱：TSK ODS-120T(150×4.6 mm, I.D.,5μm) 流动相:（A）0.1％的三氟乙酸,（B）乙腈－1％三氟乙酸（90：10），梯度洗脱 检测波长：214 nm 柱温：室温 流速：1.0 ml/min 生白能 添加剂 日立835-50型氨基酸自动分析仪；分析柱为2619阳离子交换树脂柱（2.6 mm×150 mm）；柱55℃，缓冲液流速0.225ml／min，茚三酮检测，流速0.3ml／min，进样量50μl。分析方法的重复性变异系数2.5％，各种氨基酸的回收率平均为95％。 核桃仁中氨基酸的HPLC分析测定 取核桃仁粉碎过60目筛，精密称取200 mg，加6mol/L盐酸5ml于玻璃小管中，充氮气后熔封，110℃水解18h，用4 mol/L NaOH调pH值至中性，用0.02mol/L盐酸稀释至50ml，过0.45μm微孔过滤膜，为总氨基酸分析用样品液。 用HPLC法和氨基酸分析仪测定多维氨基酸片中18种氨基酸 LC-MS/MS技术分析18种游离氨基酸 高效离子交换色谱法：主要用于蛋白质、多肽和氨基酸等的分离分析，它是根据相应的离子化程度对样品进行分离的，常用盐浓度逐渐增大的方式进行梯度洗脱的。 2～10 mmol/l的离子对试剂 高效凝胶过滤色谱法 根据生物药物的分子量及其极性来对成分进行分离测定，主要用于生化药物的分离和分子量的测定研究。 分离产物可以回收、可以用少量表面活性剂来改善分离效果、可根据化合物的形状和分子量大小来预测出峰顺序。 具有简便、快速、重现性好、样品用量少等优点。 HPGFC法测定重组仁肿瘤坏死因子（rh-TNF）衍生物的分子量 色谱条