5第五章基因克隆操作过程5五章基因克隆操作过程5第五章基因克隆操作过程5第五章基因克隆操作过程.ppt

（3）λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 （4）电穿孔转化 原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 （5）酵母的转化一般有以下两种方法： 利用酵母的原生质球进行转化 利用Li+盐进行转化 （6）植物细胞的转化及其他基因转移方法 叶盘法 电击法 基因枪法 （7）哺乳动物细胞基因导入法 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 显微注射法 DEAE葡聚糖转染技术 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 2.转化率 （1）转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体 DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转 化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此 转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，能够接纳 DNA的受体细胞数目，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组 子的受体细胞无法生长）。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108 ，即每微克pUC18 中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4×1011个 分子，也就是说，每3400个pUC18分子中才有一个分子进入受体细胞。 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2mL 感受态细胞，大约含有2×1010 个大肠杆菌细胞，也就是说，每 200个细胞中只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 （2）转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/μg载体， 经切、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 /（107/μgX 10-2）= 0.1 μg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5 μg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算 出（5 μg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 （3）转化率的影响因素 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 受体细胞：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。 2011-10-23 * 基因克隆操作过程 供体、受体的比例：Ca2+诱导转化 0.1ml 感受态细胞 50ng DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50ng DNA 转化方法：Ca2+诱导转化：106-107/μg DNA 原生质体转化：105-106/μg DNA λ-DNA转染： 107-108/μg DNA 电穿孔转化： 106-109/μg DNA 3.转化细胞的扩增 （1）扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后，37℃培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；λ噬菌体转染后，30℃培养10min等，均属扩增操作。 （2）扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序； 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选； 表达外源基因，便于筛选和鉴定。 2011-10-23 * 基因克隆操作