酵母菌的基因工程.pptVIP

5.2 酵母菌的基因工程 发展历程 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于： 安全无毒，不致病； 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 缺陷在于： 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。 5.2 .1 酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。 5.2.2 酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 先导序列 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌种的野生型质粒 酿酒酵母中的2μ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母都含有2μ双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，均有类似的结构。 酵母菌种的野生型质粒 乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。 由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2μ质粒构建的杂合质粒为Yep。 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有CEN的YCp质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。 YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有TEL的YAC质粒的构建 利用酵母