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浅谈PCR技术----特异性DNA片段的PCR扩增 生物05专升本 田江平 引 言 早期特异性DNA片段的扩增 体外DNA片段的扩增( 1983年PCR( ploymerase chain rection –聚合酶链式反应)技术的应用) 现代PCR技术在基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究及法医鉴定等诸多领域都有重要用途。 主要内容 PCR 的基本原理 PCR扩增的主要条件 靶DNA和模板 PCR引物 PCR原材料 PCR缓冲液 PCR循环的温度和时间 PCR扩增平台 PCR扩增DNA的方法 常用的DNA片段PCR扩增系统 PCR基本原理 PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的,在体外由酶催化合成特异性DNA 进行特异性DNA复制的一般过程为: 1.反应系统加热至90~95℃使底物双链DNA变性成为两条单链; 2.降温至37~60℃使两种引物分别与模板DNA链的3’一侧的互补序列杂交(复性); 3.升温至70~75℃,耐热性DNA聚合酶 催化引物按3’ 5’ 方向沿伸,合成模板DNA的互补链. 重复以上过程,经过三次循环,就出现待扩增的特异性DNA片段.(见下图) PCR扩增的主要条件 (一)耐热性DNA聚合酶 靶DNA和模板 作为PCR的靶DNA一般是一个待扩增的特定双链DNA片段,应知道其两端20~30bp的核苷酸序列,供设计对引物之用.靶DNA可以是环形DNA 分子的一部分,也可以是线形DAN分子(或片段)的一部分.作为PCR的模板是一条单链DNA片段,其3’端具有与引物杂交的序列. PCR引物 引物是PCR过程中引导互补链DNA的一种脱氧核苷酸寡聚体,其引物必须具有游离的—OH基因.为了有效地扩增特异性双链DNA片段,设计和合成合适的引物是非常重要的.设计引物应遵循以下几点: 1.根据DNA互补链聚合反应的原理,设计的引物的核苷酸必须与模板链3’端的一段核苷酸序列互补,并且3’端必须具有游离的 ---OH基因. S 2.引物的长度与PCR过程的特异性高低密切相关,引物长的,特异性高.为扩增特异性高的DNA引物片段,一般设计的引物由20~30个核苷酸组成,4种核苷酸尽可能随机分布,G与C含量应达40~60℃，尽量避免存在多聚嘌呤核苷酸、多聚嘧啶核苷酸或异常核苷酸的序列。 3.设计的引物中应尽量避免回文结构序列.尤其是在引物的3’端不应有回文结构序列。为了降低在PCR过程中形成引物二聚体，设计引物时必须避免用于同一PCR 过程中的一对引物之间存在互补序列。 4.设计的引物中，最好含有进一步操作中可利用的限制性核酸内切酶识别序列。若靶细胞DNA一端或两端不含这样的序列，则可以根据下一步操作，设计在引物5‘端添加一些与模板DNA链核苷酸序列，使扩增的DNA片段一端或两端引入核苷酸内切酶识别序列。在这种情况下，设计的引物要长一些。 5.如果扩增一个编码区域的DNA片段，设计的引物应尽量避免5’端的核苷酸与密码子的第三位置（间并）的核苷酸的互补，以次来防止3‘端的核苷酸可能同模板错配 以及由此引起的聚合反应受阻。 6.引物中的核苷酸序列与非靶DNA序列以及靶DNA中引物互补序列以及以外的核苷酸序列之间的同缘性不得超过70%，并且不能有连续8个以上相同的核苷酸序列。 PCR原材料 dATP、dGTP、dCTP和dTTP是PCR 的原材料，通过PCR过程聚合成互补链DNA。如果这些原材料中分别渗入Dig-UTP、Bi- otin-UTP、Flu-UTP等修饰过的核苷酸，扩增出标记的DNA片段。因此，采用PCR技术可以制备这些标记的DNA探针。 PCR缓冲液 PCR缓冲液平时配置2倍的浓度，含140 mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、4~8 mmoL/L MgCl2、40mmol/L (NH4)2SO4、30ug/ml BAS(无核酸酶)、16mmol/LDDT. PCR循环的温度和时间 一般的PCR循环中，变性温度采用 90~95℃ 能否使双链DNA完全变性分开，这是PCR扩增片段成败的重要原因。大多数情况下采用94℃，持续20s。快速高温处理对保持DNA聚合酶活性是必要的。 复性温度取决于引物的长度和G、C含量，对于长度为20个核苷酸、G、C含量为50%的典型引物来说，55℃是比较