荧光定量分析方法荧光定量分方法析方法.ppt

* 荧光分析法第二讲（1学时） 要求： 1.掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法； 2.了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。 第二节 荧光定量分析方法 一 荧光强度与物质浓度的关系： 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。 溶液中荧光物质被入射光(I0)激发后，可以在溶液的各个方向观察荧光强度(F)。但由于激发光的一部分被透过，因此，在激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂直的方向观测。 设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为L。荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度，即： F∝(I0-I) 为常数，其值取决于荧光效率 根据Beer定律 （2） 将(2)待人(1)，得 即 （3） （1） 根据 ，在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当ECl0.05时，(3)式括号中第二项以后的数值就不能忽略，此时荧光强度与溶液浓度之间不呈线性关系。 为荧光定量分析法的依据。 若浓度C很小，ECl之值也很小，当ECl≤0.05时，上式第二项以后的各项可以忽略。所以 （4） 荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为： 荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测所发射光(荧光)的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度(A=lgI0/I)，是一个比值，如果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高2~3数量级。 二、定量分析方法 1 依据：荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成线性关系：F=KC 2 荧光定量分析方法： 校正曲线法：配制空白溶液以及一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F0、Fs、Fx，然后作（ Fs - F0）— C 曲线，根据（Fx–F0)，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。 (2) 比例法：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定： Fs-F0 = KCs ， Fx-F0 = KCx 例题：1g谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素(VB2)及少量无关杂质，加入少量KMnO4，将核黄素氧化，过量的KMnO4用H2O2除去。将此溶液移入50ml容量瓶中，稀释至刻度。吸取25ml放入样品池中以测量荧光强度（核黄素中常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调整至刻度100处。测定得到氧化液的读数为6.0格。加入少量的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)，使氧化态核黄素（无荧光）重新转化为核黄素，这时荧光计读数为55格。在另一样品池中重新加入24ml被氧化的核黄素溶液，以及1ml核黄素标准溶液0.5μg/ml，这一溶液的读数为92格，计算每克样品中含核黄素的μg数？(课本P2307题) 解：25ml氧化液：荧光读数6.0格，相当于空白背景； 25ml测定液：荧光读数55格，实际核黄素的荧光读数为55-6.0=49格； 24ml氧化液+1ml标准核黄素：荧光读数92格； 标准核黄素0.5μg/ml：荧光读数92-6=86格； 样品溶液的浓度为： 1g谷物配成50ml溶液，取25ml测定，故谷物中核黄素为： 第三节 荧光分光光度计和荧光分析新技术 一 荧光分光光度计(fluorospectrophotometer): 1 主要部件：主要由四个部分组成即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 2 仪器的校正： 灵敏度的校正： 波长校正： 激发光谱和荧光光谱的校正： 二 荧光分析新技术简介 1 激光荧光分析法 2 时间分辨荧光分析 3 同步荧光分析 4 胶束增敏荧光分析 小结 1.荧光(fluorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 2.磷光(phosphorescence)：物质分子接受光子能量被激发后，经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级后再返回基态时发射出的光。 3.分子荧光的产生：处于基态的分子，吸收紫外-可见光后，电子由基态→激发单重态，激发态的分子不稳定，它