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六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 五.蛋白质的重要性质 （1）前处理（pretreatment）细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。 （2）粗分级（rough fractionation） 当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 五.蛋白质的重要性质 （3）细分级（fine fractionation） 是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。 （4）结晶（crystal）由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 透析和超滤 透析（dialysis）和超滤（uItrafiltration） 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 b. 密度梯度（区带）离心 c. 凝胶过滤（gel filtration） 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 （2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法 等电点沉淀（isoelectric precipitation） 蛋白质的盐溶和盐析 有机溶剂分级分离 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 电泳--在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）。 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 五.蛋白质的重要性质 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 b. 离子交换层析（ion-exchange chromatography） 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分离纯化的一般方法 五.蛋白质的重要性质 （3）根据蛋白质电荷不同的分离方法 c. 亲和层析法（affinity chromatography） 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 3.蛋白质分子量的测定方法 五.蛋白质的重要性质 凝胶过滤测定蛋白质的分子质量 凝胶过滤层析法（gel filtration chromatography）或称为分子排阻层析（size exclusion）或分子筛层析（molecular sieve chromatography）能够测定完整的蛋白质分子质量 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 3.蛋白质分子量的测定方法 五.蛋白质的重要性质 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 3.蛋白质分子量的测定方法 五.蛋白质的重要性质 (2) SDS测定蛋白质的分子质量 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分子量的测定方法 五.蛋白质的重要性质 (3) 毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（CE）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。 六、蛋白质的的分离、纯化与鉴定 2.蛋白质分子量的测定方法 五.蛋白质的重要性质 (4)质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（ESI）可以测5万Da的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmol）量的蛋白质，精确度为0.01%。