植物组培实验课稿.doc

实 验 报 告 实验名称：烟草植物组织培养 班级：姓名：学号： 烟草植物组织培养 实验目的 1、学习植物组织培养技术的基本原理； 2、掌握培养基配制方法、步骤及培养环节中，外植体灭菌、接种、培养观察等技术环节； 3、了解外植体脱分化及再生过程。 实验原理 植物细胞全能性（totipotency） 指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。 2、植物细胞表现出全能性的条件 离体状态； 有一定的营养物质，激素和其他外界条件（如无菌、温度、pH ）； 选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型； 3、组织培养 组织培养(Tissue culture)是指在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织(器官或细胞)的技术。广义的组织培养：包括器官培养，组织培养，胚胎培养，细胞培养，原生质培养，花药培养等；狭义的组织培养是指植物离体快繁技术卸微型繁殖(Mieropropagation)或试管繁殖技术。 4、常用的培养基 植物组织培养常用培养基为MS基本培养基。凝固剂常用琼脂粉，它最主要的作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水化合物，从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐渐失去凝固能力。 5、植物激素 （1）培养基中添加的激素是植物激素，是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠等许许多多的生理生化活动。在培养基的各种成分中，植物激素所产生的影响最大。通过对培养物营养需求的研究，可拟定出目标培养物的培养基配方，对植物生理过程的探索，可了解并获得最有成效的植物激素，这两个方面可以认为是植物组织培养不可或缺的二个层面。基本培养基保证培养物的生成与最低的生理活动，只有配合使用适当的植物激素才能诱导细胞的分裂，愈伤组织的生长以及根、芽的分化或胚壮体的发育等。对于培养大多数植物材料来说，选择任何一种常用的基本培养基都能得类似的效果，只有植物激素的种类和浓度搭配合理，才能生长出健壮的植株，这一点要根据瓶中培养物的表现来确定。 （2）常用于植物组织培养的植物激素种类主要有生长素、细胞分裂素、赤霉素。生长素的生理作用主要是促进细胞生长和细胞分裂，诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力，形成愈伤组织，促进生根。细胞分裂素的生理作用主要为促进细胞分裂与扩大，可使茎增粗，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，抑制、延缓衰老，有保鲜的效果。赤霉素(GA)的生理作用主要是诱导芽的细胞伸长。对矮生型植物恢复成高生型特别有效： IAA／GA比值高有利于木质部分化，比值低利于韧皮部分化。 实验材料 植物材料：烟草叶片 2、实验药品：MS培养基（见表. 2-1）、蔗糖、琼脂、升汞、NAA、6-BA、NaOH。 3. 仪器设备：高压灭菌锅、光照培养箱、天平、PH计、超经工作台、酒精灯。 4. 器械及用具：镊子、手术刀、记号笔等 5. 玻璃器皿：培养瓶、量筒、容量瓶等。 实验步骤 培养基的选择及母液配制（常用的培养基MS、B5、N6、WPM等） （1）大量元素配成10倍母液，使用时每1L培养基需要从母液中取100ml。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合微量元素配成100倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。 （3）铁盐单独配制，与其它元素混合易造成沉淀。一般采用鳌合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大100倍。EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75~80℃之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe2+。有机物质可配成100倍浓缩液，使用时每1000 ml培养基加10 ml。 培养基的配制 取1000 ml烧杯，先加入500 ml的蒸馏水，然后根据培养基成分及用量，吸取各种母液加入烧杯，称取蔗糖（一般用量3%）、琼脂（一般6-8g/L），按需要的浓度加入植物激素，加水至800 ml，加热使琼脂融化，定容到1000 ml，用1N NaOH或HCl调PH至5.8。 培养基灭菌 将配好的培养基迅速分装至50 ml三角瓶中，用牛皮纸或报