《生化大实验》.ppt

《生化大实验》 实验课程简介 生化大实验是一门综合性的实验课程，教学的目的在于通过对生命物质的分离制备，纯化，分析等综合性实验，在已掌握的基础生物化学理论知识和生化实验常用方法的基本原理、基本操作技术（如滴定、比色、层析、电泳等）的基础上，训练学生的综合实践动手能力，掌握蛋白质、酶、核酸等重要物质的分离、纯化等的测定技术。 目 录 实验一 蛋白质含量的测定 实验二 离子交换法血清纯化IgG 实验三 离子交换层析法分离血清白蛋白 实验四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量 实验五 等电聚焦法测定样品的等电点 实验六 质粒的分离与纯化 实验七 PCR扩增目的基因片段 实验八 酶联免疫吸附实验 实验一 蛋白质含量的测定 （一）考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595 nm吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。 蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。 【实验仪器及用品】 1. 标准蛋白液（0.1mg/ml）0.2g结晶牛血清白蛋白用0.9%NaCl 稀释到2000ml。 2. 0.9%NaCl 3. 考马斯亮蓝试剂：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 5%乙醇中，加100ml85%磷酸，蒸馏水稀释1000ml，滤纸过滤。 4. 待测蛋白：人血清，用前用0.9%NaCl稀释200倍。 5. 漩涡混合器 6. 移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2）， 5ml（×1）7. 分光光度计8. 试管1.5cm×15cm (×8)9. 量筒100ml(×1)10. 电子分析天平11. 试管架(×1) 【实验内容及步骤】 一、标准曲线线的绘制 取7支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。 以A595为纵坐标，标准蛋白质年浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2. 未知样液的测定  另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】 1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。 2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。 【思考题】 1、根据一下要求选择一种或者几种蛋白质定量测定蛋白质浓度。 （1）样品不容易溶解，但要求结果很准确。 （2）要求在半天内测定60个样品。 （3）要求很迅速的测定一系列试管（30只）中溶液的蛋白质浓度。 2、试着比较该法与其他几种方法的优缺点。 二、紫外分光光度法测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法。 【实验原理】 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。 利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。 不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。 【仪器与试剂】 1. 紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。 2. 标准蛋白质溶液：0.9%?NaCl溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。