如何选择HPLC溶剂.ppt

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如何选择HPLC溶剂 斯百全化学(上海)有限公司 400-856-0488 +86-21 高效液相色谱法(HPLC) 20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术 目前已成为生物化学、医学研究、药物临床、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的化学分离分析手段 1、定性分析 2、定量分析(用于化合物含量及纯度分析) 简单来讲,使用HPLC分析的主要目的在于分离一个混合物中各个组分,并定量出各组分在混合物中所占的比重。 工作过程: 通过高压泵, 连续的将流动相按照一定流速流过柱子;通过进样器,注入样品混合物。由于混合物中各组分性质不同,因而它们在柱內移动速度不同而逐渐分离。通过检测器检测,得到组分的电信号并进行放大;记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来,由此得到液相色谱图。 高效液相色谱法(HPLC) 分离原理: 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滯留时间不同,从而先后从固定相中流出 在色谱分析中,如何选择最佳的 色谱条件以实现最理想分离, 是色谱工作者的重要工作, 也是用计算机实现HPLC 分析方法建立和优化的任务之一 高效液相色谱法(HPLC) HPLC分离指标 分离度:无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其它峰、內标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。不一定是两种待测物的分离度,而有可能是它们与其最接近的干扰物的分离度。应当尽量保证1.5,2.0比较理想,再大也可以,但沒太大意义。 峰型:窄而对称的峰最为赏心悦目,这也是保证良好分离度的因素,同时有利于定量的准确和良好的重现。(拖尾引子:通过计算5%峰高处峰宽与峰顶点至前沿的距离比来评价峰形的参数。) 塔板数:和半峰宽相关。半峰宽越小,塔板数越大,峰就越窄,分离越好。究竟要多大,应以良好的分离为准。 保留时间:要求的是重现性,是色谱定性的依据,同时也決定了分析时间 RSD(标准偏差)2 正确选择流动相直接影响检测结果和仪器的损耗! 高效液相色谱法(HPLC) 液相色谱系统的很多问题都能在谱图上反映出來,其中一些问题可以通过改变 设备参数得到解決,而其它的问题必须通过修改操作程序来解決。 谱图问题 与流动相或溶剂有关的原因 解决办法 峰拖尾 流动相pH选择错误 调整pH值。 (对于碱性化合物,低pH值更有利于得到对称峰) 峰前延 样品溶剂选择不恰当 使用合适的溶剂 峰分叉 样品溶剂不溶于流动相 改变样品溶剂 鬼峰 流动相问题 a.检查流动相是否纯净 b.使用流动相作为样品溶剂 c.减少进样体积 保留时间波动/不断变化 流动相组分变化选择不恰当 防止变化(蒸发、反应等)/a.更换合适的流动相 b.选择合适的混合流动相 基线漂移 流动相污染、变质或由 低品质溶剂配成 /不均匀/配比不当或流速变化 检查流动相的组成,使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂/使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂,流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气/更改配比或流速,定期检查流动相组成及流速 基线噪音(规则的) 流动相混合不完全 用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂 基线噪音(不规则的) 流动相污染、变质或由低质溶剂配成/流动相各溶剂不相溶 检查流动相的组成/选择互溶的流动相 宽峰 流动相组成变化 重新制备新的流动相 分离度降低 流动相污染或变质 (引起保留时间变化) 重新配置流动相 对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键! HPLC溶剂的要求 (1)高纯度,溶剂与固定相不互溶,并能保持色谱柱的稳定性 由于高效液相灵敏度高,对流动相溶剂的纯度要求也高。不纯的溶剂会引起基线不稳,或产生“伪峰”)。 (2)溶剂对于待测样品,必须具有合适的极性和良好的选择性,即足够的溶解能力 溶剂的极性要与待测样品相匹配,如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不但影响纯化分离,且会使柱子恶化。 (3)溶剂要与检测器匹配 对于UV-Vis,所用流动相在检测波长下应沒有吸收或吸收很小 (4)化学稳定性好 不能选与样品发生反应或聚合的溶剂 (5)低粘度,沸点适中 减小溶质的传质阻力,降低柱压,利于提高柱效。 常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等;粘度过低的溶剂也不宜采用,如戊烷、乙醚等,易在色谱柱或检测器內形成气泡,影响分离 HPLC溶剂的要求 HPLC溶剂关键性能 UV吸收性 HPLC级试剂是用

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