2.1.5淀粉胚乳细胞的Evansblue染色.ppt

* * 姓名：王敏 学号: M05308 导师： 顾蕴洁 前言 细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是由某些特定基因参与调控的，在细胞生长发育以及对外界刺激的反应过程中有关键作用的一种重要生物学过程。胚乳细胞去核之后，细胞并未立即死亡，继续进行淀粉和贮藏蛋白的合成与积累，最终被贮藏物质充满时成为死细胞，完成其程序性死亡过程。因此，研究水稻胚乳细胞PCD，对于弄清水稻灌浆与籽粒充实有重要意义。 PCD在植物体整个生长发育过程中普遍存在。植物体在胚胎发育、根、茎、叶、花等器官的形态建成、细胞增殖分化过程中,都伴随有PCD的发生。 营养生长中的PCD现象 糊粉层细胞的退化消失 根冠细胞的死亡 导管分子的形成 叶片的形成与衰老 生殖生长中的PCD现象 大小孢子的形成与发育 雌、雄配子体的发育 胚的发育 单性花的形成 1 植物PCD的检测方法 经历PCD的植物细胞呈现一些典型的形态学特征。应用光学显微镜和电子显微镜便可以观察到细胞的变化。不管是在细胞水平还是在细胞器水平上均能观察到发生PCD的植物细胞的典型形态学特征。 1. 1 形态学观察 1.2 DNA ladder检测 发生PCD的细胞染色质DNA在核小体间断裂成200bp及其倍数的片段。因此在琼脂糖凝胶上能得到DNA ladder图谱。这是PCD最重要的特征之一，常作为PCD的特异性生化指标而被广泛应用。若将DNA断片用放射性核素标记，电泳后进行放射自显影，则可使灵敏度提高50~100倍。 1.3 DAPI荧光检测 DAPI( 4，6-Diamidino-2-phenylindole)染色剂与DNA结合在琼脂糖凝胶上的检测灵敏度是EB(ethidium bromide)的几倍。通过流式细胞仪它可被用于分析PCD过程中DNA结构和含量的改变。将发生PCD的植物细胞与DAPI以适宜的比例混匀，在荧光显微镜下观察，可见细胞核出现明显的凋亡特征，而对照细胞的细胞核为均匀明亮的荧光。 1.4 彗星电泳法 彗星电泳(comet assay)又叫单细胞电泳技术和微凝胶电泳。最早是由Ostling和Joharson于1984年建立的。用以检测一个细胞中由于辐射诱发的DNA断裂片段。因为细胞在凋亡过程中有不同程度的DNA片段化，应用彗星电泳在单细胞水平上检测凋亡可提高观测的灵敏性。 1.5 酶联免疫法(ELISA) 当细胞发生凋亡时，核酸内切酶激活，在核小体连接区切开双链DNA，产生带有单个或寡聚核小体的DNA片段。再利用小鼠单克隆抗体两端分别与DNA和组蛋白结合的“夹心定量酶标免疫测定法”原理，可以特异测定凋亡细胞裂解物中的单个或寡聚核小体。此法操作简便快速，目前己有商品ELISA试剂盒上市。 由于流式细胞仪可对细胞进行大量快速准确的测定，短时间内即可获得大量相关信息，如细胞的大小、内部结、DNA，RNA，蛋白质，抗原等一系列重要的物理特性和生化特征，因此流式细胞术在PCD研究中越来越受到人们的重视。 1.6 流式细胞仪法 1.7 原位末端标记(TUNEL) 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法最早是由Gavrieli等建立的。发生PCD的细胞DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3-末端从而可进行凋亡细胞的检测。 2.1.1 糙米粒增重及日平均灌浆速率 籽粒增重最快的时间是在开花后第6天到第12天,开花13天以后灌浆速率和籽粒增重明显减慢。一个值得注意的现象是花后第13天开始，日均灌浆速率突然下降，从糙米粒增重动态看出籽粒的贮藏物质的70%-80%是在开花后第12天以前所积累起来的，而这正是淀粉胚乳去核化发育阶段。 2 水稻胚乳PCD过程的代谢水平 2.1.2 SOD及CAT的变化 超氧化物歧化酶活性 过氧化氢酶活性 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶在开花后第6天到12天活性最高，花后第13天以后这两个酶的活性都明显下降，所不同的是SOD活性在花后21天到24天稍有回升，而CAT酶活性没有这种回升现象。 2.1.3 ADPG焦磷酸化酶和可溶性 淀粉合成酶活性变化 ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶在胚乳花后第6天到第9天酶活性直线上升，10-12天达到峰值，13-15天成直线下降，花后15-24天维持在一个较低的水平。 2.1.4 淀粉分支酶活性变化 淀粉分支酶(Q酶)的活性特点是花后第6-15天快速上升，峰值到来的时间后移到花后第15-21天，到花后22天才明显下降。 2.1.5 淀粉胚乳细胞的Evans blue染色