3种植物花螺原体的分离及其基本特性.doc

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q 3种植物花螺原体的分离及其基本特性 于汉寿，阮康勤，纪燕玲，陈永萱，王志伟 (南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京 210095) 摘要：透射分别从油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhododendron simsii)、红花浆草(Oxalis corymbosa)种植物花表分离到4株螺原体CNR-1和CNR-2、CNA-1、CRW-1，对其形态部分生理生化特性及分子生物学特性进行了初步研究。4株螺原体在R-2液体培养基中生长良好，能通过孔径为0.22 ?m的微孔滤膜；在R-2固体培养基上呈圆形或颗粒状菌落，菌落直径约50600 ?m；可呈典型的螺旋状，菌体直径为37.04370.40 nm，长度约0.8911.88 ?m；都能利用葡萄糖作为碳源，不能利用尿素；在不含胎牛血清的R-2培养基中，它们都不能生长菌株CNR-1、CNA-1能强烈代谢精氨酸，而CNR-2和CRW-1不能代谢精氨酸；在氨苄青霉素钠浓度高达2000 U/mL的R-2培养基中，菌株生长良好。根据16S rDNA序列构建的系统发育树显示，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1螺原体CRW-1与S. clarkii聚类较近；根据ITS序列构建的系统发育树显示，CRW-1形成一个单独的分枝。以上结果初步表明分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1CRW-1可能是一个新的螺原体种，但还需要血清学试验进一步验证。油菜杜鹃螺原体(Spiroplasma)是一螺旋状、无细胞壁的原核生物，基因组小（78~2.22 Mb）是能独立生活和自我复制的最简单的原核生物[]。作为一类重要的微生物资源，由于其形态结构和营养代谢的特点，螺原体[2, 3]。 绝大多数螺原体分离自昆虫和扁虱，在几种植物体内或花表也分离到螺原体[4]。有些螺原体对宿主有致病性，如螺原体Spiroplasma apis和S. melliferum导致蜜蜂（Apis spp.）“五月病”（May disease）和“爬蜂病”，S. citri，S. kunkelii和S. phoneiceum分别引起柑橘顽固病(Citrus stubborn)、玉米矮缩病(Corn stunt)和紫苑黄化病(Aster yellow)，而大多数螺原体和宿主之间是共生(Mutualism)或互生(Commensalism) 关系[4]。 有许多研究证实花上螺原体与昆虫之间有密切的关系，Clark认为蜜蜂螺原体在蜜蜂体内出现和消失的时间与植物开花时间一致表明花可以作为传播中间体[5]，这种推测得到Davis等的支持，后来大量植物花螺原体的发现进一步支持了这种观点[6]。目前一般观点认为，花上螺原体可能是携带螺原体的昆虫在取食花蜜或花粉时留下的,花仅是作为定居场所在昆虫传播中起作用，这种推测也被食叶昆虫及非虫媒花上没有发现类似的螺原体所支持[4]。但是，直接从植物花分离得到的螺原体从哪里来？在自然界中如何传播？螺原体是否在植物花上增殖？是否进入植物体内？是否对植物产生什么影响？这些问题目前尚不清楚。 国际上已有36个螺原体有效种的记录，但国内有关螺原体的研究极少[7,8]。为获得我国的螺原体资源，并为以后进一步研究螺原体与宿主之间的相互关系，2005年3~7月间，我们从江苏省南京市东郊采集了大量的植物花分离得到4株螺原体，并研究了其基本生物学特性。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 供试植物花和螺原体菌株：用于分离螺原体的植物花有油菜(Brassica napus)、杜鹃(Rhododendron simsii)、红花酢浆草(Oxalis corymbosa )、(Paeona suffruticosa)、现代月季(Rosa hybrida)、虞美人(Papaver rhoeas)、诸葛菜(Orychophragmus violaceus)、唐菖蒲(Gladiolus hybridus)等80多种都是在华东地区于37月间开花的植物。暗视野显微镜Olympus BH-2，透射电子显微镜H7650。 1.2 螺原体的分离及纯化 分离所用培养基是由C-3G简化后的R-2培养 基[]。0.45 ?m的微孔滤膜过滤于30静置培养逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜(Olympus BH-2)观察验证。[8]。 1.3 分离物的滤过性及对青霉素的抗性 取1 mL培养物用孔径0.22 ?m的滤膜加压过滤，在暗视野显微镜下检查是否有菌体存在。在R-2培养基中加入不同单位的氨苄青霉素钠以检查螺原体对青霉素的抗性[7]。 1.4 螺原体的形态及运动性观察 应用负染法在电子显微镜下观察分离菌株的形态[7]。取0.5处于不同生长期的螺原体培