转基因食品安全--第四部分转基因生物安全管理与检测课稿.ppt

第四章转基因生物安全管理与检测 108 106 102 104 T 绝对定量法 外源基因标准曲线 内标准基因标准曲线 ＊ 获得的是样品中的植物基因组DNA或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。 绝对定量法 基因植物（外源基因）基因组质量或拷贝数×100 样品转基因含量（%）＝ 植物（内标准基因）基因组质量或拷贝数 相对定量法 内标准基因 外源基因 ΔCT(ΔCT =参照基因的CT–转基因的CT值） VS 转基因含量之间的标准曲线 定量PCR方法的关键参数 特异性 Specificity 灵敏度 Sensitivity 准确度 Accuracy 重复性 Repeatability 重演性 Reproducibility 特异性与灵敏度 只能在含有靶序列的转基因产品中检测出阳性信号! 需要测试不同植物品种 需要测试不同的转基因植物 足够低的检测灵敏度，满足转基因标识的要求 检测极限（LOD） 定量极限（LOQ） 定量PCR方法可接受和应用基本要求 Applicability Scope of the method, interferences with analytes etc. Practicability Equipment, timing, practical difficulties Specificity Event-specificity Dynamic Range Include the 1/10 and at least 5 times the target concentration Accuracy Within ± 25% of the reference value R2 Coefficient ? 0.98 PCR efficiency - 3.1 ? slope ? 3.6 RSDr Below 25% over the whole dynamic range LOQ Less than 1/10th of the value of the target concentration with an RSDr ? 25% LOD Less than 1/20th of the target concentration Robustness Deviate not more than ± 30% RSDR Below 35% at the target concentration; 50% below 0.2% Trueness Within ± 25 of the accepted reference value over the whole range 荧光染料： SYBR Green I、Eva Green 引物特异性探针： Amplifluor (Intergen) Scorpions探针 通用模板探针（AUDP, UT） LUX（Light Upon Extension）探针 序列特异性探针： 荧光能量共振转移探针 （FRET) 双标探针（TaqMan 、 TaqMan MGB 、LNA、Allglo ） 分子信标（Molecular Beacons，MB) 实时荧光定量PCR荧光探针类型和基本原理 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I原理 荧光染料法 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 优点： （1）高度的通用性，几乎可以用于任何型号的定量PCR仪和任何目标DNA序列的扩增。 （2）无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低。 （3）PCR反应后可以进行融解曲线分析，分析反应的特异性和目标序列的突变等。 缺点： （1）不具备目标序列特异性，不能用于Multiplex PCR反应，容易受污染物， 非特异性扩增产物和引物二聚体的干扰。 （2）定量的准确性不高，重复性不强。 （3）高浓度的染料会抑制PCR反应。 Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量转移探针（FRET Probe） 序列特异型探针 优点： （1） 为杂交型探针，自身不被降解，其荧光信号是可逆的，PCR反应后可以进行融解曲线分析，突变分析，SNP基因分型以及产物鉴别 。 （2）包含两条探针，具备很高的目标序列特异性，不受引物二聚体和非特异扩增的影响。 缺点： 由于