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高效液相色谱 第一节 概述 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 二、HPLC与GC比较 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 差别：分析对象和流动相的差别 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为非惰性液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 三、HPLC的特点 特点：“三高” “一快” “一广” 第二节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 1高压输液系统 （1）溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L。用来贮存足够数量，符合要求的流动相 （2）高压泵 1）对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好 2）恒流泵是给出恒定流量的泵;优点是流量不受流动相粘度和色谱体系中其余部分阻力变化的影响、易于调节控制，死体积小，便于清洗和更换流动相，很适于梯度洗脱;缺点是输出有脉冲波动,为减小脉动，常用两个泵头并加脉冲阻尼器 3）恒压泵是保持输出压力恒定，优点：能供给无脉动的输出，并能提供大的输出流量，缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的实验，也不便于梯度洗脱；恒压泵通常用于匀浆法装填色谱柱 （3）在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线漂移，噪音增加,也可采用超声脱气和真空脱气 （4）梯度淋洗装置 在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果、缩短分析时间的目的 2．进样装置 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样，装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差 2）高压定量进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好 3．色谱柱 （1）概述：目前常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15－30cm的直形不锈钢柱，填料颗粒度为5－10μm，柱效以理论塔板数计大约为5000－20000。目前液相色谱柱发展的趋势是减小填料的颗粒度（3－5μm）和减小柱径，以提高柱效，但是这对仪器和技术的要求将更高  液相色谱柱的柱效不仅取决于柱填料的性能，而且和装柱技术关系极大。HPLC的装柱是一项技术性很强的工作，通常都是由专业人员操作，一般实验室不能自行装柱 4．检测器 （1）对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 （2）检测器的类型：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应，属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应，属于此类检测器有示差折光检测器等 1）紫外光度检测器 原理：待测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律 紫外－可见光检测器有固定波长和可变波长两类，光源波长是固定的，通常用汞灯的254nm或280nm谱线 紫外光度检测器特点 灵敏度高；应用范围广；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱；溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长 紫外光电二极管阵列检测器原理 采用光电二极管阵列作检测元件，阵列由211～512个光电二极管组成（二极管越多，分辨率越高），每一个二极管测量一段波长的光谱。具有组分特征吸收的全部波长经光栅分光后同时被检测 紫外光电二极管阵列检测器 紫外光电二极管阵列检测器特点 同时获得信号强度值是保留时间和波长的函数，即获得三维色谱图，同时获得多种信息，使得每个组分在整个波长范围内的光谱信息大大增加，可迅速获得最佳选择性和灵敏度的波长 2）荧光检测器 原理：紫外光照射样品，组分受到激发跃迁至激发态，返回基态的过程中发射的谱线，谱线强度与组分含量成正比 荧光检测器的特点 优点：灵敏度高（比紫外检测器的灵敏度高2个数量