凝胶过滤和亲和层析GelFiltrationandAfinityChromatography.ppt

仪器分析课程 凝胶过滤和亲和层析 凝胶过滤（Gel filtration） 一、概念：以多孔凝胶材料为固定相，利用材料的分子筛特性，按照样品分子的大小和形状对组分进行分离的一种液相色谱。 二、原理：在凝胶色谱柱中，凝胶颗粒之间和内部孔径均充满了溶剂。洗脱时，样品随溶剂一起通过色谱柱。由于各组分分子大小和形状不同，所以进入孔径的能力不同。不能进入任何孔径（或称完全被排阻在孔径外）的大分子将从颗粒间隙通过，最先被分离出来。而较小的分子要经过颗粒的间隙和部分内部孔径，因此以一个较慢的速度通过色谱柱，并随分子的大小和形状不同产生差异，达到分离的目的。 三、凝胶过滤的材料 最常使用的材料是聚合的有机化合物，它们都具有立体的孔型网状结构。 （一）、交联葡聚糖（Sephadex） 交联葡聚糖为葡聚糖与表氯醇交联得到的，改变交联度可以得到不同类型的Sephadex。 排阻极限：被凝胶完全排阻在孔外的大分子的最低分子量，称为凝胶的排阻极限。 吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。 （二）、琼脂糖凝胶（Sepharose） 由琼脂制成的线性多糖，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖交替组成。 一些Sepharose凝胶的特性 四、凝胶过滤的参数和公式 对于某一种凝胶，一种溶质在其内部和外部溶剂之间的分配由一个分配系数Kd决定，它是溶质分子大小的函数。 如果是大分子溶质，完全被凝胶内部所排阻，则Kd = 0，如果溶质分子足够小，完全进入内部溶剂，则Kd = 1，由于凝胶内部孔径大小不同，对于中等大小溶质，可以进入部分内部溶剂，不能进入全部内部溶剂，Kd就在0与1之间变化。 对于一个凝胶过滤柱，有几个体积的参数： Ve为洗脱体积，即样品被洗脱出层析柱的体积， V0为外水体积，即凝胶颗粒间隙中溶剂的体积， Vi为内部体积，即凝胶内部孔径中溶剂的体积。 Vi = a·Wr，a为干胶重，Wr为吸水值。 这些体积间存在关系式 Ve = V0 + Kd·Vi，也即 Kd = 对于两种不同分子量和Kd值（Kd’和Kd’’）的物质，它们的洗脱体积之差Vs应是 Vs = Ve’ –Ve’’ = ( Vo + Kd’Vi ) – ( Vo + Kd’’Vi ) = (Kd’ – Kd’’)Vi 五、凝胶过滤的应用 （一）纯化：对生物大分子的纯化。如病毒、蛋白质、酶、激素、抗体、核酸和多糖等。 （二）分子量的测定：球形蛋白质的洗脱体积主要是由它的分子量决定的，在一个相当的分子量范围内，洗脱体积大约是分子量对数的线性函数。用相同形状的和已知的蛋白质作出一条校正曲线，测定洗脱体积后可从校正曲线得到分子量。 （三）溶液的浓缩：加入干胶，溶液的水和小分子被膨胀的凝胶吸收。 （四）脱盐：盐可被看作是小分子。 （五）测定平衡常数：例如药物的蛋白结合率。药物本身分子量较小，与蛋白结合后成为分子量较大的物质，通过凝胶过滤将二者分开。 六、凝胶过滤的实验设计 目的：包括达到最好的分离，最大的回收率，最小的样品稀释，尽可能短的分离时间。 分辨率（Rs）= （一）、凝胶类型的选择 1.组分离：当两种成分分子量差距很大时采用，例如脱盐。凝胶选择使高分子量的洗脱体积在外水（Vo），区带窄，稀释少。低分子量的洗脱体积接近Vt。脱盐一般推荐Sephadex G-25。 2.分级分离：当分离几种分子量接近的组分时，应该使用各种凝胶的选择性曲线，避免几种成分的洗脱体积接近Vo或Vt。 3.分子量测定：要使样品分子量落在选择性曲线的线性部分及处于校正标准品的中间。一般推荐使用Sephacryl S-200 superfine, Sephacryl S-300 superfine或Sepharose CL-6B。这些胶对水溶性差使用助溶剂不会造成影响。 如果可选择的胶有交搭，应该选择较低排阻极限的，这样可以分离的时间短，回收率高。 （二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄，分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快，适用于制备，组分离。 （三）、层析柱的选择 1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。 （四）、样品量 较难的分离：样品体积占床体积的1-5%。 组分离和一般分级分离：可根据情况，