利用各种解离断裂方式分析蛋白肽及蛋白质组学研究.ppt

利用各种解离/断裂方式分析蛋白/肽及蛋白质组学研究 自由地解离Freedom of dissociation CID MSn MSA PQD ETD HCD ECD IRMPD 肽/蛋白用多种手段解离，可获得更完整、更精确的信息！ 蛋白鉴定和翻译后修饰PTM分析 自由地解离!——LTQ XL CAD MSn 多阶激发 Data Dependent MS3分析PTMs LTQ XL 带 ETD “离子/ 离子反应” LTQ Orbitrap——更高能量的CID（HCD） LTQ FT Ultra——ECD和IRMPD 解离模式和碎片 解离模式和碎片 灵活性和强大功能 选项 质量精确度 谱图采集时间Cycle time MS/MS谱图信息 获得分析目标的多种方式 序列覆盖 Cycle time 各段序列互补 PTM翻译后修饰分析 优化的碎裂方法 精确质量 De novo测序 完整、完全的谱图 精确质量 Top Down vs. Bottom Up 从一个基因到多个蛋白 Freedom of Dissociation 的应用 复杂体系蛋白质组：用ETD 和CID互补，提高蛋白覆盖率 磷酸化蛋白质组研究的模型系统 iTRAQ CID丰富的b系列离子和HCD丰富的y系列离子互补 综合应用各种解离方式De novo测序 Top Down解析磷酸化异构体 1. 复杂体系Proteome: T. brucei Flagelli 用ETD 和CID提高蛋白覆盖率 1. ETD和CID: T. brucei Flagellar 蛋白质组 1. ETD和CID: T. brucei Flagellar 蛋白质组 1. 利用CID和ETD获得序列的互补性——高效的蛋白质组学方法 2. 磷酸化蛋白质组研究的模型系统 2. 磷酸化肽的富集 2. 1. 用ETD的LTQ分析 ETD谱 提高磷酸化肽的覆盖率 O-连接的糖基化: YSPT(O-GlcNAc)SPSK N-连接的糖基化 PTM：分析糖基化肽，CID vs ETD 多位点磷酸化的肽 ——用C-Trap的HCD解离 2.2. 包含pTyr的肽——CTrap 2.2. 用C-Trap分析磷酸化肽 C-Trap提供了更高能量的断裂途径 C-Trap断裂谱图包含大量的信息 中性丢失 骨架断裂 鎓离子 内部碎片（非骨架） 鎓离子pTyr m/z 216.0426可被作为诊断离子 由于Orbitrap提供高精确质量测定，因此可具有极度精确的选择性 3. iTRAQ标记的肽的解离——CTrap 3. BioWorks 3.3 ——鉴定和定量 用iTRAQ标记的9个蛋白混合物 高分辨率的iTRAQ 报道的离子 9种蛋白混合物期待的比率是 1:2:2:10 用C-Trap定量 在C-Trap中的碎裂没有低质量cut off 报道的离子显示非常好的强度；它们在谱图中是主要离子 精确质量测定消除了干扰，并提高了定量的精密度 由BioWorks 3.3处理的数据可以给出优质的报告 4. HCD丰富的y系列离子：TMITDSLAVVLQR m/z 723.90的MS/MS谱 5. 重现的nanoLC 5. 几种方法De novo测序比较 5. 用Orbitrap HCD进行自动De novo测序的峰（总共提交了167 DTAs） 6. Top Down的ECD/ETD，定量测定人的Cardiac Troponin I的磷酸化异构体 Top Down vs Bottom Up 人类Troponin-1：重组的谱图 人类Troponin-1：重组的谱图 ECD on a +32 mono phoshoisoform 碎片告诉我们磷酸化位点了么？ 人类Troponin-I: IRMPD on 2P-isoform Troponin-I的离子阱质谱谱图 737（单磷酸化）异构体的CAD图 b31 at m/z 699.7的 ETD MS3 谱 ～20种不同的异构体 智能化解离 Thermo Fisher蛋白质组研究解决方案 使用极严格的质量精度范围精确定量iTRAQ报道的离子（~10mmu） 动态范围：～60 1040/18 4. CID丰富的b系列离子： TMITDSLAVVLQR m/z 723.90的MS/MS谱 样品：6种蛋白的混合物，Cys+58.0055 Nano-LC, peptide trap柱，75 um C18 BioBasic柱 水/乙睛：0-40% 30min梯度 确认到正确位置上的氨基酸残基Residue 柱状图显示绿色：成功的，红色：失败的 氨基酸被确定的基础是肽的长度分布 氨基酸残基正确率2252/2475＝91%，15个氨基酸长的肽序正确率98% C-Trap解离的