原子力显微镜在单分子研究中的应用-中国细胞生物学学报.doc

原子力显微镜在纳米生物学研究中的应用 蒋青青1 张利娟2 张 钰1 郭 彦1 任 炜1 张晓晖1 王鑫艳1( (1中国科学院生物化学与细胞生物学研究所, 上海200031, 2重庆市畜牧科学院, 重庆 402460) 摘要 原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)自从1986年发明以来，作为一种重要的单分子研究工具，在包括细胞粘附、蛋白折叠以及蛋白间的相互作用等生物学过程的研究中得到了广泛应用。本文主要介绍原子力显微镜的原理，着重于研究相互作用时能垒大小的确定，以及常用的单分子表面修饰方法。 关键词 原子力显微镜(AFM); 单分子; 能垒; 表面修饰 1 引言 着重阐述研究相互作用时能垒大小的确定，以及常用的单分子表面修饰方法。 2 原子力显微镜简介Fig. 1 Schematic of the atomic force microscope (AFM) 一束激光直接打在微悬臂上，继而反射到裂像光电二极管上面，通过不同的A-B信号就反映出施加给探针的力。微悬臂小位移时遵从胡克定律，所以微悬臂弹性系数校正后的光电二极管信号即反映了探针和样品间的相互作用力。 2.2 典型的原子力显微镜力曲线 采用原子力显微镜，Lee[12] 和Florin[13] 直接测出了单个亲和素和生物素解开的力。尽管这种方法1994年才第一次报道，到现在已有数百种蛋白间相互作用的研究采用了这种或者类似的方法。 在研究抗生物素蛋白链菌素streptavidin)与生物素biotin)的相互作用时，所检测出的是典型的力曲线：测量开始后，压力首先增大，然后移动琼脂糖小球逐渐接近微悬臂。小球和微悬臂接触前，偏离/力信号保持在稳定基线对应的零点力处。小球与微悬臂接触后，微悬臂就向上弯曲，导致偏离/力信号发生正向变化。当达到了预设的力时(本例中是200 pN)，压力就停止增加。抗生物素蛋白链菌素抗生物素蛋白链菌素Fig. 2 A representative unbinding trace A representative atomic force microscope (AFM) force scan (i.e., optical signal vs. piezo displacement) under force scan mode. The two interacting surfaces are the AFM tip functionalized with streptavidin and an agarose bead with immobilized biotin. 2.3 探针与基底的表面修饰 在研究蛋白-蛋白相互作用的时候，蛋白或者配体被固定在原子力显微镜微悬臂的探针上，相互作用的受体被连接在一个合适的表面。当两个表面相互接触，探针离开表面时分子的相互作用力被悬臂的形变反出来。因此合适的探针和样品处理对于这类研究的成功是非常重要的。修饰探针的方法通常包括物理吸附和使用带有特殊基团交联分子的共价连接，修饰基底与修饰探针的方法相似——物理吸附或共价连接，云母、聚苯乙烯、玻璃以及镀金的云母表面，都是常用的使用基底。 常用的物理吸附方法见图3A，在戊二醛的帮助下，小分子蛋白可以吸附在探针或基底表面，如生物素，然后可以通过与表面吸附的分子有作用的蛋白把后续所需的蛋白固定在基底或探针的表面。Franco和Yves在2005年对细胞凝集素和肝素的相互作用的研究中使用了这个方法[14]。 Fig3 Schematics of surface chemistries commonly used for modifying atomic force microscope (AFM) tips A: Functionalization of AFM tips with streptavidin using physisorption. B: Covalent coupling of proteins via a heterobifunctional poly(ethylene glycol) (PEG) cross-linker: The amine-reactive N-hydroxysuccinimide (NHS) end of the cross-linker reacts with amines on the silicon tip, yielding a stable amide bond, and the reactive 2-[pyridyldithio] propionate (PDP) group forms a bond