四、蛋白质的提取.ppt

（三）蛋白质的提取和分离纯化 大多数蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液。部分与脂类结合的蛋白质可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。 1.水溶液提取 稀盐(0.15mol/L)和缓冲溶液对蛋白质溶解度大,稳定性好,是常用的蛋白质提取液.5°C以下操作,防止热变性. 同时加蛋白质水解酶抑制剂-碘乙酸 控制pH在等电点附近. 2.有机溶剂提取 与脂类结合的蛋白质,分子中含有非极性侧链的蛋白质不溶于水、稀盐、稀酸、稀碱的水溶液,但可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂中。 3.表面活性剂提取 用非离子型表面活性剂可以提取水盐系列无法提取的蛋白质和酶,但随后分离困难,要小心使用. 蛋白质的分离纯化p218 如测单一结构蛋白，则必须分离纯化。 为了研究某一个蛋白质的结构，必须首先将该蛋白质 从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化 . 纯化方法（见218－226） 1. 沉淀法 2. 色谱法 3. 电泳法 4. 离心法 5. 膜分离法 6. 双水相系统萃取法 1.沉淀法 盐析法、PEG沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、热处理沉淀法 （1）盐析法 蛋白质水溶液加入盐的浓度对蛋白质的溶解度有显著影响. 低浓度的盐能增加对蛋白质的溶解度,称为盐溶; 当盐的浓度增加时,蛋白质的溶解度下降并析出,称为盐析.这是由于高浓度的盐离子易与水结合,夺取了蛋白质的水化层,使蛋白失水,凝聚并沉淀析出 不同蛋白质盐析所需的离子强度不同，盐析法就是建立于此的分离方法。 盐析时常用的盐是硫酸铵,它溶解度大(515g/L),应用范围广,不易引起蛋白质变性. 血浆中蛋白质盐析的例子硫酸铵浓度 沉淀的蛋白质 占总蛋白质的比例g/100mL % 20 纤维蛋白 428-33 优球蛋白 3 40-46 假球蛋白 2450以上 清蛋白 69盐析沉淀后的蛋白质需要用透析法脱盐 （2）PEG法 聚乙二醇是水溶性非离子型聚合物，记做PEG-XX. XX表示平均分子量，越高的粘度越大，沉淀蛋白质所需用量越少，但低分子量PEG选择性更强。 沉淀相关因素：PEG的聚合度、PEG浓度、蛋白质分子量、蛋白质浓度、介质pH值、介质离子强度、温度。 PEG易吸收水分，是沉淀机理。 （3）有机溶剂沉淀法 有机溶剂的加入使介质的介电常数下降，使蛋白质分子间静电作用力增强；同时有机溶剂还可降低蛋白质分子表面的水合程度，从而导致沉淀。常用有机溶剂是乙醇和丙酮。 有机溶剂能使蛋白质变性，一般低温下操作，加入适量中性盐。 某些金属离子可使蛋白质在有机溶剂中溶解度降低。 （4）等电点沉淀法 蛋白质在水溶液中一般以离子态溶于水,在等电点时电荷为零, 消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。 此时蛋白质沉淀析出.不同的蛋白质等电点不同,据此可对蛋白质提取物进行初步分离. （5）热变性沉淀 多数蛋白质都易热变性，所以可通过加热使杂蛋白变性沉淀而被除去，用于纯化热稳定酶。 2.色谱法 常用的有：排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、经典的吸附色谱等。 （1）凝胶过滤色谱 Sephadex 交联葡聚糖凝胶 缓冲液中加盐防蛋白吸附 Bio-Gel 聚丙烯酰胺凝胶 可分辨分子量只相差5000Da的蛋白质 Sepharose 琼脂糖凝胶 湿态提供 Fractogel TSK 合成的亲水乙烯基凝胶过滤材料 凝胶过滤色谱的流动相 使用以水做基体具有不同pH值的多种缓冲溶液做流动相。 流动相中加入少量无机盐，维持流动相的离子强度为0.1-0.5，以消除体积排阻色谱法中不希望存在的吸附作用与基质的疏水作用。 体积排阻色谱的影响因素 填料。化学键合的硅胶和亲水树脂凝胶。 柱长。分离度与柱长的平方根成正比。60－120cm对于蛋白质的分离比较理想。 洗脱液。pH值接近中性 流速。小于0.1ml/min 样品容量。样品浓度0.01~0.5%;蛋白质样品体积为柱体积的1～3％ 蛋白质在变性洗脱条件下的分离 （2）离子交换色谱 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素在蛋白质纯化中最常用。前二者交换容量大。 二乙基氨基乙基（DEAE）常用于分离中性或酸性蛋白质。高于pH值为9时，需用三乙基氨基乙基（TEAE）。中性或碱性