基因分离.ppt

* * 定位、分离和鉴别影响猪脂肪沉积性状的硬脂酰辅酶A去饱和酶 (SCD) 基因 任军，黄路生，丁能水，艾华水，郭源梅， Christoph Knorr, Bertram Brenig 江西农业大学 引言 基因定位 基因分离 多态标记鉴别 相关性分析 内容 引言 - 瘦蛋白（leptin）基因的发现 Leptin缺失型小鼠(ob/ob): -肥胖表型 Leptin: -调节体重和能量代谢平衡 - 减少 采食量 - 促进能量消耗和脂肪代谢 Zhang, Science, 1994 左: ob/ob 小鼠 右: 正常小鼠 引言 -leptin 基因和 SCD 基因的互作 SCD缺失型小鼠(abJ/abJ) 在高脂肪日粮的饲养条件下仍表现出清瘦的表型 Ntambi, PNAS, 2002 ob/ob (bottom)× abJ/abJ Double mutant mouse (ob/ob, abJ/abJ; top) SCD 是Leptin代谢通路中的重要调控元件，Leptin通过下调SCD酶活性抑制肥胖表型 lean Cohen, science, 2002 引言 -leptin 基因和 SCD 基因的互作 硬脂酰辅酶A 棕榈酰辅酶A SCD oxidation 油酸 棕榈酸 饱和性脂肪酸与不饱和性脂肪酸的比率 甘油三脂的成分 肥胖 细胞膜的通透性 信号传导 引言 -SCD 在脂肪代谢中的调控作用 多不饱和性脂肪酸合成的限速酶 Leptin代谢通路中的重要调控元件 哺乳动物脂肪沉积性状的重要侯选基因 引言 -SCD 在脂肪代谢中的调控作用 基因定位 -鼠/猪体细胞杂种克隆板的扫描 M M 16 27 23 21 M M SSC14G 10 12 18 19 26 P N 28 44 45 46 48 51 P N 57 60 62 68 69 72 75 77 86 90 92 95 96 99 100 112 114 115 P N 基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 连锁群 SW2122-SW361-SW328-SCD-S0007-SW1333-SW2507-SWR1042-SW886 . 最紧密连锁的标记:猪14号染色体的S0007 (17cR, LOD 16.83) 基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 SSC14q26-27 基因定位 -鼠/猪辐射细胞杂种克隆板的扫描 SSP SP PP Plate 4 signals 3 signals 1 signal TAIGP714 K1477Q 基因定位 -PAC基因组DNA文库的筛选 SSC14q27 基因定位 -荧光原位杂交分析 基因分离 -PAC 克隆的酶切和杂交 KF/LR-114bp AF/BR-591bp Southern 杂交 9 条阳性杂交带含有 SCD 基因片段 1 2 3 4 5 6 HindIII-9.0 kb SacI-2.4 kb XbaI-5.7 kb BamHI-3.7kb BamHI-3.7kb HindIII-3.2 kb BamHI-5.1 kb SacI-8.0 kb XbaI-1.8 kb KpnI-1.7 kb Ex3-Ex4-1.6 kb Ex4-Ex5-1.7 kb Ex5-In5-0.5 kb Primer walking 基因分离 -亚克隆和序列拼接 采用 5 /3 RACE 策略分离SCD基因全长cDNA 大小: 5134 bp; 超长的3’ UTR ORF: 1080 bp 蛋白质: 359 aa Motif: 2 poly(A) 加尾信号 3 mRNA 非稳定基序 (AUUUA) 基因分离 -全长cDNA的分离 Histidine motif: essential for oxidation (HXXXH; HXXHH) 基因分离