实验三提纯菠萝蛋白酶的分子量的鉴定—SDS-PAGE.ppt

SDS鉴定菠萝蛋白酶的纯度 一、实验目的 1、学习和掌握电泳（SDS）的基本原理及电泳技术。 2、熟练配制SDS相关各种试剂。 二、实验原理 电泳:带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 影响电泳的主要因素 （1）颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。 （2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。 （3）pH值 （4）离子强度：溶液的离子强度一般在0.02～0.2mol/kg之间电泳较合适。 （5）溶液粘度 （6）电渗 （7）焦耳热 （8）筛孔 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳。 这种凝胶是由丙烯酰胺单体(简称 Acr)和交联剂 N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵[(NH4)2S2O3](简称Ap)，催化剂是N，N，Nˊ，Nˊ-四甲基乙二胺(TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。 每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用T％表示。 凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C％表示。 不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还具有浓缩效应。 (l) 浓缩效应 (2)电荷效应 (3)分子筛效应 Gel 5% 10% 15% 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 实验试剂配制 30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis), （先用约50ml蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热30~50℃溶解,再用量筒定容至100ml，然后过滤，后置于棕色瓶,4℃下保存备用）。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 (2) 10%过硫酸铵(AP)溶液：取2g过硫酸铵溶解后，用20ml dH2O溶解，现配现用。 (3) 1 mol/L HCl 500ml：取浓HCl 42 ml，加蒸馏水至500 ml(在通风橱中操作)。 (4) 分离胶缓冲溶液（1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8）:取18.15g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液约48ml，调pH至8.8, 定容至100ml。 (5) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8): 取6g Tris溶解后，加1mol/L HCl溶液40ml，调pH至6.8，定容至100ml 。 (6) 10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液: 取5g SDS加水定容至50ml。（加热溶解） (7) 2×电极缓冲液(0.1%SDS–0.05mol/L Tris–0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸和1g SDS加水溶解后，定容至１000ml（配好的溶液pH8.3）(12个组可配2升,使用时再稀释2倍)。 (8) 样品溶解液：取SDS ２g，β-巯基乙醇 ５ml，甘油10ml，溴酚蓝0.1g，0.5mol/L pH6.8 Tris–HCl缓冲液 (浓缩胶缓冲液)10ml，加蒸馏水25ml，(最后的总体积为50 ml),装于棕色瓶。 (9)染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450 ml 甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至1000 ml。(12个组可配2000 ml) (10)脱色液 高甲醇1000ml：甲醇 454ml，冰醋酸75ml，dH2O 471 ml 低甲醇1000ml ：甲醇 50ml，冰醋酸75ml，dH2O 875 ml 七．实验步骤 1.清洗并吹干玻璃板。 2.在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。 3.把玻璃板放入电泳槽中。 4.用小烧杯加6ml蒸馏水，2ml 30%凝胶储液，20 ul TEMED，100ul 10％过硫酸铵，混匀，迅速倒入封口槽处(一定要快！)，静置约10min直到凝固。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 5.加dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。 6.按下表用小烧杯配12%分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约1～1.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为15～30min，胶与水分层，倾倒去水。 12%分离胶 5%浓缩胶 30%凝胶贮液 4000μl 8