实验注意事项-兰州理工大学精品课程.doc

兰 州 理 工 大 学 专业综合实验2实验指导书 （蛋白质与酶工程部分） （四年制生物工程专业） 王永刚 编写 生命科学与工程学院 二零一二年十月 目 录 实验注意事项： 3 实验一 盐析法提取卵清清蛋白 4 实验二 蛋白质溶液的脱盐 6 实验三 蛋白质溶液的浓缩和干燥 7 实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定 8 实验五 弱酸性树脂的预处理及装柱方法 13 实验六 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法） 15 生物工程专业综合实验 实验注意事项： 实验中培养学生对科学研究工作的严肃态度、严格地要求、严密的工作方法和实事求是的作风，并初步具备客观地对事物进行观察、比较、分析、综合和解决实际问题的能力。 为达到上述目的，要求做到以下几点： 实验前： 1.仔细阅读实验指导，了解实验的目的、要求、方法和操作步骤，领会其设计原理； 2.结合实验内容，复习有关普通生物学、生物化学、分子生物学等方面理论知识，做到充分理解； 3.预测实验中各个步骤可能出现的情况； 4.注意实验中可能发生的问题 实验中： 将实验仪器妥善安排，正确装置； 严格按照实验指导上的步骤进行操作，防止人员、环境污染； 认真、细致地观察实验过程中出现的现象，随时记录各项指标； 爱护仪器设备和用具，节约药品、试剂及水电，保持实验室的安静整洁。 试验后： 整理实验结果，经过分析思考，写出实验报告，按时交给指导老师； 整理实验仪器清洗干净后妥善放置； 做好实验室的清洁卫生工作。 实验报告的内容要求 通过本课程的实验和实习，培养学生理论联系实际、严肃认真、实事求是的科学态度，要求遵守纪律、安全操作，确保实习实验顺利进行。 实验前必须了解实验室习内容和有关课程内容，明确实验目的、操作规范、认真，独立思考、认真观察，做好记录，按时完成实验实习并按规定完成实验实习报告。 实验报告的内容主要包括实验目的、原理、材料、操作规程及实验结果。所有实验应准确记录各实验技术参数，并对实验结果进行讨论。 注意：提交实验预习报告，预习报告不是千篇一律的抄袭实验讲义，可以利用简要的示意图勾画出实验步骤，同时标注出每一步骤的注意事项及目的。 课程成绩由考勤、预习报告、课堂提问、实验操作动手能力、实验报告等部分构成。 实验一 盐析法提取卵清清蛋白 一、实验目的 掌握盐析法提取卵清清蛋白的原理和方法。 二、实验原理 在生物化学研究中，为了研究某些蛋白质成分的结构与功能及其在代谢过程中的变化，需要将这些蛋白质分离出来，并加以提纯。向含有多种蛋白质的溶液中加入不同浓度的中性盐，不同性质的蛋白质便可能分别沉淀下来，这种提取分离蛋白质的方法称为盐析。这种方法虽然古老，但由于所需设备简单，操作方便，处理量大，并有保护蛋白质不易变性的作用，所以目前仍被广泛使用。 盐析作用的机制复杂，盐离子会吸引大量水分子而使蛋白质脱去大分子表面的水膜，从而使蛋白质分子容易碰撞聚集；盐离子的带电集团远远超过蛋白质，因而中和了蛋白质所带电荷，使蛋白质分子不互相排斥而聚集沉淀。如果将溶液的pH值调到某一蛋白质的等电点，这时该蛋白质就更容易沉淀下来。 盐析作用遵循下列几条规律： 1．盐溶液的浓度愈大，蛋白质的溶解度愈小； 2．不同的蛋白质在同一浓度的盐溶液中溶解度不同； 3．一种蛋白质在不同种类的盐溶液中溶解度不同； 4．盐析作用受pH值和温度的影响。很多中性盐都可用来盐析蛋白质，其中以硫酸铵应用最广。用硫酸铵盐析的优点是：1.硫酸铵在水中溶解度大，温度系数小；2.不易使蛋白质变性；可在室温下操作；3.不必严格调节pH值。其缺点是所得的产品含盐量高，须脱盐处理，才能进行下一步纯化。 清蛋白又称白蛋白。是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。存在于动物组织、体液和某些植物的种子中。其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固。其重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麦清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。人血清（或血浆）清蛋白占血清蛋白质的55～63％，是血清中少数不含糖的蛋白质之一；分子量67500道尔顿，有584个氨基酸残基和高净电荷（等电点4.9）；与水、Ca2+、Na+、K+、脂肪酸及胆红素都有较好的结合能力卵清蛋白，是一种糖蛋白，含有微量的磷，系卵清中蛋白质的主要成分，约占65％。鸡的卵清蛋白分子量约4万5千道尔顿，氨基末端是甘氨酸，但其氨基被乙酞化。羧基末端为脯氨酸，等电点pH约4.7（离子强度=0.01），容易结晶。三、实验用品 材料：鸡蛋清 试剂：固体硫酸铵粉末（分析纯），1M硫酸（调节pH值） 器材：高速制备型冷冻离心机；酸度计，10ml离心管，250ml烧杯，玻璃