木聚糖酶活力特性研究-福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司欢迎您！.doc

木聚糖酶活力特性研究 郑翔鹏 （福建省燕京惠泉啤酒股份有限公司） 概况 木聚糖酶分子只含一个亚基分子量在8～30kD间的为碱性蛋白，分子量在30～145kD间的为酸性蛋白。PI值为3～10.5，稳定pH值为3～10反应最适pH值在4～7之间，最适温度为40～60,Ag+ (离子浓度1 mmol·L - 1 ,抑制酶活达100% ) 、Hg2 + (离子浓度1 mmol · L - 1 , 抑制酶活达7013% ) 、Cu2 + (离子浓度2. 00 mg·ml- 1 ,抑制酶活达25. 42% )等离子抑制木聚糖酶的活性,Mg2 + (离子浓度2. 00 mg·ml- 1 ,提高酶活达6% ) 、Mn2+ (离子浓度1 mmol·L - 1 ,提高酶活达24% )等离子则能提高木聚糖酶的活性。Ag+ 、Hg2 + 、Cu2 +等离子主要通过改变酶分子中2SH基团的还原态或直接攻击酶分子中的某些氨基酸残基,改变酶的构象来抑制木聚糖酶的活性， Mg2 + 、Zn2 +等则通过影响酶与底物的结合及解离状态,提高酶的活性,其具体机制还有待进一步研究。 木聚糖酶的分子结构由功能结构域和连接区构成。其中，功能结构域由催化结构域和纤维素结合结构域构成纤维素结合结构域可改变酶对可溶或不溶底物的活力。根据结构域的相似性，木聚糖酶可通过结构域的改组和随后结构域的修饰而进许多木聚糖酶具有纤维素酶的活性。木聚糖酶与木聚糖的结合利用离子间的静电作用。木聚糖含有的4-O-甲基葡糖醛酸带负电，木聚糖酶在pH低于PI时带正电荷，易于结合，而在pH值高于PI时，则不易结合。其反应为典型的酸碱亲核水解反应。?木聚糖酶木聚糖酶酶木聚糖酶木聚糖酶50℃、pH值为5.3的条件下，每分钟从浓度为10mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。 1.1.1分析原理 木聚糖酶能将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。 1.1.2主要试剂（略） 1.1.3标准曲线的绘制 吸取水1.0ml，加入DNS试剂3.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，制成标准空白样。分别吸取木糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，分别用水定容至100ml，配制成浓度为0.10～0.50mg/ml木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入3mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以木糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。 1.1.4样品制备 固体试样应粉碎或充分碾碎，然后过60目筛（孔径为0.25mm）。液体试样可直接称取。称取试样，精确至0.001g。加入250ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液。磁力搅拌30min，再用缓冲溶液定容至500ml，在4℃条件下避光保存12h，过滤。再用缓冲溶液做二次稀释（稀释后的待测酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.04～0.08U/ml之间）。 1.1.5 测定 吸取10.0ml木聚糖溶液，50℃平衡10min。吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，50℃平衡10min。吸取1.00ml经过适当稀释的酶液（已经过50℃平衡），加入到刻度试管中，再加入1.0ml木聚糖溶液，50℃保温30min，立即加入3.0ml的DNS溶液混匀，沸水浴加热5min（从试管放入重新沸腾时算起）。用自来水冷却至室温，在540nm处测定吸光度A。吸取1.00ml木聚糖溶液（已经过50℃平衡）,加入到刻度试管中，50℃精确保温30min。加入3.0mlDNS试剂和1.00ml经过适当稀释的酶液，混匀，以终止酶解反应。沸水浴加热5min（从试管放入重新沸腾时算起），用自来水冷却至室温，在540nm处测定吸光度A0。 1.1.6计算 r×Df 木聚糖酶活力（U/g）＝ ×1000 150.14×t 式中： r：通过OD值从标准曲线上查得与标准木糖溶液相对应的浓度（ug/ml）； 150.14：木糖的相对分子质量； t： 酶解反应时间，min； Df ：稀释倍数 酶活力的计算值保留三位有效数字。 1.1.7结果分析 本研究分析了8种各酶制剂厂家提供的复合木聚糖酶木聚糖酶木聚糖酶木聚糖酶 在不同PH条件下影响参数选择为：底物浓度0.5%