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实验二、动物性食品生物性污染 物的检验 动物性食品卫生学实验 一.生物性污染的来源 微生物污染 (microorganism pollution ) 寄生虫污染 (parasitical pollution ) 昆虫污染 (insectical pollution ) Pathogens Spoilage Organisms Viruses Bacterium Foodborne Infection Microorganisms Unpleasant smell and taste Fungi 内源性污染 外源性污染 外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径 二.生物性污染的评价指标 菌落总数 细菌总数 大肠菌群值（MPN） 致病菌检测(PCR法) 其他 实验目的 掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常见致病菌PCR检测的原理、步骤和方法 了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进行卫生判定 1.牛奶的微生物学检验 菌落总数的测定 检 验 处 理 24 ±2h或48 ±2h 36 ±1 ℃ 报 告 菌落记数 每皿加入适量营养琼脂 选择3个适宜稀释度，吸取1ml加入灭菌平皿 作成几个倍数的稀释液 注 意 事 项 无菌操作 稀释度的选择 平均菌落数在30-300之间的稀释度为宜； 每个稀释度作三个平皿 记数要求 30-300 ＞300 ＜ 30 ＞300或＜ 30 2.牛奶大肠菌群值的测定 报 告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)检样中大肠菌群的最可能数。 判定标准 3. 常见致病菌的快速检测 ——SE的PCR检测 原 理 以扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。 PCR的基本成分 模板DNA 特异性引物(SEF14) 热稳定DNA聚合酶 dNTP 二价阳离子 缓冲液 过 程 (高温变性、低温退火、中温延伸) 引物设计 利用引物设计软件Primer5.0针对SEF14主要结构亚单位sefA的基因序列设计引物: 上游引物Usef A为5′-ATGCGTAAATCAGCATCTG-3′；下游引物LsefA为5′-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3′ 样品处理（模板制备） 以12000rpm离心5min,上清液即含基因组DNA 待检肉样乳1g/mL 以9mL增菌液混合研碎，制成食品匀浆液 37℃振荡培养3小时 取样液1mL 以2000rpm离心2min,取上清液 以8000rpm离心5min,沉淀以50uL悬浮 沸水浴10min后迅速置冰浴5min 反应体系 10 ×buffer 2.5uL MgCl2 2.5uL dNTP 0.5uL 上游引物（20uM） 0.5uL 下游引物（ 20uM ） 0.5uL 模 板 1uL Taq聚合酶 0.25 uL 灭菌ddH2O up to 25uL 反应参数 1. Initial denature 95 ℃ 4 min 2. Denature 95 ℃ 50 s 3. Anealing 52 ℃ 50 s 4. Elongation 72 ℃ 50 s Return to 2 for 35 cycle 5. Final elongation 72 ℃ 5 min Keep 4 ℃ 10 min 琼脂糖凝胶电泳 电泳条件：argrose 1% U 80V