天津大学生物化学05第五章——《核酸化学》幻灯片.pptVIP

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2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶1) (1)牛胰脱氧核糖核酸酶(DnaseI) (2)牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseII) (3)限制性内切酶(限制酶) 2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶2) (1)牛胰脱氧核糖核酸酶(DnaseI):此酶无碱基专一性,它切断双链DNA或单链DNA成为以5,-磷酸为末端的寡核苷酸,平均长度为四个核苷酸,需Mg2+,最适pH7-8。 (2)牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII):也无碱基专一性,降解DNA成为以3,—磷酸为末端的寡聚核苷酸,平均长度为六个核苷酸,最适pH4-5,需0.3mol/L的Na+激活。Mg2+可以抑制此酶的活性。 2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶3-1) 是1979年,Arber、Smith和Nathams等人在细菌体内发现的一类对DNA具有极高碱基专一性的内切酶。 是DNA顺序测定,基因分离和基因体外重组等研究中十分重要的工具酶。 这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA,但不降解自身细胞的DNA。 一般识别顺序包含4-6个碱基对。 (3)限制性内切酶(限制酶) 2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶3-2) 大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构(反向重复序列)。 (3)限制性内切酶(限制酶)2 T T A G C A C G T G C T A A A A T C G T G C A C G A T T 反向重复 3, 5, 3, 5, 2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶3-3) 大多数酶切割后形成粘末端 (3)限制性内切酶(限制酶)3 G A A T T C C T T A A G 3, 5, 3, 5, EcoRI G A A T T C C T T A A G 3, 5, 3, 5, + 粘性末端 粘性末端 2.脱氧核糖核酸酶类(DNA酶3-4) 少数酶切割后形成平整末端 (3)限制性内切酶(限制酶)3 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3, 5, 3, 5, HindII 平整末端 G T Py Pu A C C A Pu Py T G 3, 5, 3, 5, + 3.非专一性核酸酶类1 (1)蛇毒磷酸二酯酶 (2)牛脾磷酸二酯酶 3.非专一性核酸酶类2(1) 对RNA、DNA都有作用,是从核苷酸链的3,—羟基端开始,逐个切开5,- 核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键,得到5,-核苷酸。 (1)蛇毒磷酸二酯酶 P P P H2O OH P P P OH OH + 3.非专一性核酸酶类2(2) 可作用RNA和DNA,是从5,-羟基端开始,逐个切开3,-核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键,得3,—核苷酸。 P P P H2O OH + (2)牛脾磷酸二酯酶 P P OH P P P OH (二)核酸的杂交技术1 意义:核酸杂交可以在液相或固相上进行,是基因工程和分子生物学的重要技术之一。是鉴定阳性重组体、筛选基因、确定DNA的同源性、研究基因定位、组建DNA的物理图谱、研究DNA的间隔顺序等的有效手段。 原理:核酸(DNA)的变性和复性的性质,也就是在带有互补顺序的同源单链间的配对过程中,DNA单链可重新形成双链,DNA单链也可与RNA互补成为杂交分子。因此有DNA类、DNA-RNA类两种杂交。如把已知序列的分子预先用放射性同位素(32P)标记(称为探针,Probe),即可用其识别或“钓出”另一分子中的同源部分。 (二)核酸的杂交技术2 Southern 印迹法:利用上述原理,1975年英国分子生物学家E.M.Southern首先发明的一种杂交 “印迹法”。 此法是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后,再进行杂交 具体方法参见北大P352,353。 (二)核酸的杂交技术3(1) 1.将DNA样品经限制性内切酶降解后,用琼酯糖凝胶电泳进行分离 2.将胶浸泡在碱(NaOH)中使DNA变性 3.将变性DNA转移到硝酸纤维膜上(膜只吸附变性的DNA) 4.800C烤4-6h,,使DNA牢固地吸附在膜上 DNA- DNA杂交实验法1 (二)核酸的杂交技术3(2) 5.与放射性同位素标记的、变性后的DNA探针进行杂交,此过程需要在较高的盐浓度及适当的温度(一般680C)下进行了几~十几个小时 6.洗涤除去杂交标记物 7.将膜烘干后进行放射自显影 DNA- DNA杂交实验法2 (二)核酸的杂交技术3(3) Nor

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