1生物大分子的制备2蛋白质（酶）的分离纯化.ppt

第四章 样品的全息制备 1 生物大分子的制备 2 蛋白质（酶）的分离纯化 1 生物大分子的制备 1.1 概述 1.2 生物大分子制备的前处理 1.3 生物大分子的分离纯化 1.4 样品的保存 1.1 概述 　　在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，如果没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前提，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。 　　与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴ 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵ 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多、流程长。 ⑶ 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷ 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 ⑸ 生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同。 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ① 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。 ② 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ③ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ④ 生物材料的破碎和预处理。 ⑤ 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑥ 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 ⑦ 产物的浓缩、干燥和保存。 分析测定的方法主要有两类： 即生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法 (紫外/可见、红外和荧光等分光光度法)、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。 要了解生物大分子的物理、化学性质主要有： ① 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ② 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③ 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④ 各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 ⑤ 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 ⑥ 对其他生物分子的特殊亲和力。 　　生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。 各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 1.2 生物大分子制备的前处理 1.2.1 生物材料的选择 　　制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 　　选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 　　动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 　　植物要先去壳、除脂。 　　微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 　　生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。 1.2.2 细胞的破碎 　　不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 (1) 机械法： ① 研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆。 ② 组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后再用10000～20000r/min的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎。 (2) 物理法： ①反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室温（或40℃）迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 ②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 ③