section j nalysis and uses of cloned dna(chinese)section j analysis and uses of cloned dna(chinese)section j analysis and uses of cloned dna(chinese)section j analysis and uses of cloned dna(chinese).ppt

Analysis and uses of cloned DNA * * * * Section J Conents 1 2 Characterization of clones(主讲人：骆礼华) Nucleic acid sequencing (主讲人：敖 丽) 3 Analysis of sequences (主讲人：李进波) Characterization of clones（克隆的鉴定） 鉴 定 内 容 测定重组DNA分子的大小、限制图谱（Restriction mapping）、基因的方向以及核苷酸的序列等克隆的部分或全部的特性。 在鉴定前需要纯化的已克隆DNA 1 现在对克隆进行部分或全序列的测定往往是第一步。这是因为序列分析虽然可提供推测基因的大小、限制图谱以及方向或者可读框（ORF），但仍须有实验证明推测基因确实在某生物体的一些细胞中转录成RNA，而对于那些编码蛋白的基因还要证明所预测大小的蛋白确实在体内被合成。 D N A 的 制 备 从细菌菌落进行质粒DNA的制备： 可通过碱裂解法、酚抽提法、乙醇沉淀法、氯化铯梯度法等方法制备DNA。 从噬菌体颗粒的载体中制备： 先用噬菌斑经纯化的噬菌体在允许细胞裂解的条件下感染细菌，然后从裂解液中移去细胞残骸，经直接离心或在高盐溶液中的聚乙二醇沉淀来从细胞裂解液中回收噬菌体颗粒。再经苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，最终得到DNA。 restiction map(限制图谱) 定义：描述染色体上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。显示为基因组DNA上不同酶切位点的相互关系的图谱，具有种质特异性。限制图谱是通过用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后测定片段之间的距离，通常以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。 用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进行酶解，可以构成标明该DNA分子的酶切位点和片段大小的限制图谱。 一个限制图谱代表特定限制酶识别靶位点的线性序列。限制图谱中的距离直接用碱基对(简写bp)来测量，而较长的距离用kb 表示，指DNA中1000 个碱基对或者RNA中1000个碱基。在染色体水平上，图谱用兆碱基对表示(1Mb=106bp)。 SalⅠ在EcoRⅠ或 BamHⅠ克隆位点附近切割并从载体上释放出插入片段，形成 大小约9kb、15kb和19kb的三个片段，而插入片段内部没有SalⅠ切割位点。 HindⅢ可产生4kb、7kb、11kb、21kb四个片段，可以确定的是21kb片段是由短臂加上2kb，但剩下的两个片段仍不能确定。 SalⅠ+HindⅢ双酶切可产生19kb、7kb、6kb、5kb、4kb、2kb六个片段，SalⅠ将21kb切割成（19+2）kb，将11kb切割成（6+5）kb，而6kb、7kb是插入片段的一部分。 然而当某种限制酶的切点较多，且双酶解产生的图谱又很复杂是，部分酶解技术可以提供制作完整限制图谱所需要的信息。 这一过程通常是在DNA片段的一个末端加上一个修饰过的、或具放射活性的核苷酸，形成末端标记。 经末端标记分子的部分酶解图所制作的图谱 用EcoRI完全消化标记的10kb片段产生出1、2、3、4kb四个片段，而部分酶解能产生出所有可连续的片段，当总DNA被酶解后再经EB（溴化乙锭）染色显示出6、7、10kb的三条增加条带。 3、4、6kb的片段可由多种方式产生，但部分酶解泳道被放射自显影来显示那些末端标记的分子，切割图谱应该是3、4、6、10kb。 核 酸 标 记 radioactive labeling（放射性标记）：常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。 Non-radioactive labeling（非放射性标记）：可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。 5’端标记可用多聚核苷酸（polynucleotide kinase）来进行，将具有放射活性的磷酸加到具有游离5’-OH的核酸上，而其将由碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）去磷酸化（dephosphorylation）所产生。ATP的最外端的γ-磷酸是用来标记的标记源。 而对于3’端标记则可用末端转移酶（terminal transferase）向核苷酸的3’端加上一个或多个核苷酸进行。 电泳 印迹转移 NC膜 杂交 自显影 Southern 和Northern印迹杂交一般步骤 Southern analysis Steps of Southern blot Theoretical mel