生化工程进展课件.pptVIP

根据限速步骤的观点，与代谢途径中催化其他生化反应的酶相比，限速酶则以较低的速度催化该反应，因而这些所谓的限速酶控制着整个代谢途径的总运行速度。 如果要提高代谢途径的代谢流，就必须增加限速酶的浓度或（和）酶活水平，即通过加速限速步骤的反应速度实现这一目标。 然而，许多实验的研究结果表明，大幅度提高代谢途径中限速酶的酶活水平并不能导致代谢流的显著增加。 例如： (a) 在粗糙脉孢菌(Neuropra crassa)的精氨酸合成途径中，控制限速步骤的酶的浓度增加仅仅使该途径中部分代谢物的流量增加，但另一些代谢物的流量反而有所减少，也就是说，这种改进并没有提高整个代谢途径的代谢流，用限速酶的概念显然不能解释这种现象 (b)利用DNA重组技术对酿酒酵母糖酵解途径中的一个或多个被认为是限速步骤的酶进行修饰，分别构建了这些关键酶高活力的菌株，但是也没有观察到乙醇产率及细胞生长速度的显著变化，这表明通过增加基因拷贝数提高某一特定酶表达量的方法，同样不能有效提高目标代谢流 (c)酿酒酵母色氨酸合成途径中限速酶的控制系数很小，即使限速酶超量表达，仍然不能有效提高色氨酸的合成速率，而且随着酶活力的增加，限速酶对代谢流的控制能力反而趋于减小 ②分析技术 在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学工程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢途径改造的思路。 　 这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代谢网络的组合法以及代谢网络优化技术等。 例如: （1）Seressiotis 等提出的MPS(Metabolic Pathway Synthesis)体系可系统地构建生化途径，从而推测出产物的可能途径； （2) Mavrovouniots 等利用计算机辅助设计生化途径，将计算出的最大理论转化率与代谢途径中诸多因素相结合，并在多个化学计量学因子的限定条件下模拟出底物到产物的可能途径。 ③基因操作技术 在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。 这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA在细胞内的稳定维持等。 展望和存在问题： 　代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发 　到目前为止，事实上许多物种的基因转化和表达仍然存在技术上的困难，另外，由于细胞本身复杂的调控机制使得单基因操作在代谢工程中往往难以奏效，所以需要基于多重调控基础上的多重调节多基因操作技术的发展 代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定的目的代谢产物或其有过量生产能力的工程菌应用于工业生产 根据微生物的不同代谢特性，常采用三种方法: (1)改变代谢流; (2)扩展代谢途径; (3)构建新的代谢途径。 改变代谢途径 (a)加速限速反应 例如将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数，在宿主中表达以实现目的产物产率的提高。 因为，代谢网络是一个整体，限速反应步骤流量的改变会对整个代谢途径造成很大的影响，从而提高目的代谢产物的产量 (b)构建代谢旁路、改变能量代谢途径 除了通过相关代谢途径的基因操作改变代谢流这种直接方法外，改变能量代谢途径或电子传递系统也可以有效改变代谢流 (c) 改变分支代谢途径流向 提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞争上占据优势，从而提高目的代谢产物的产量 (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。 扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系利用原来不能利用的底物。 (3) 构建新的代谢途径 可通过转移代谢途径，或直接构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢工程的应用领域包括10个方面： ①发酵工业方面，用于提高微生物合成天然目标产物的得率和生产能力； ②扩大微底物利用范围； ③生产原来不存在的新物质； ④提高菌体对环境的适应能力，如耐受缺氧、改善同化氮的能力或抑制性物质的能力； ⑤阻断或降低副产物的生成； ⑥在环境工程方面降解有害废弃物及有害物质； ⑦制备手性化合物，作为医药中间体； ⑧在医疗方面，用于整体器官和组织的代谢过程分析，用于鉴定基因治疗或营养控制疾病的目标； ⑨信息传导途径方面，进行信息流分析，