出血热标本采集和检测方法.doc-广东省疾病预防控制中心.doc

肾综合症出血热标本的采集和检测 一、病例和健康人群标本的采集、保存和运输 1. 标本采集：病例标本需采集急性期和恢复期血液标本各5ml以上，健康人群采集血液标本5ml以上；尿液标本需要采集急性发病期第一天或第二天的晨尿，尿液需采集30ml； 2. 标本分装：将采集的血清标本一式两管进行分装；尿液标本用密封管保存； 3. 标本的保存：标本放-20℃以下冰箱保存； 4. 标本运输：用标本运输箱4℃条件下运输。 二、鼠标本的采集、保存和运输 1. 采集标本前要做好个人防护，避免被老鼠咬伤； 2. 在采集老鼠标本前，每个载物台事先用塑料薄膜铺垫，保证每宰杀一只老鼠就要更换一次塑料薄膜，避免载物台污染； 3. 将老鼠固定在载物台上，腹部朝上，用剪刀剪开老鼠腹腔和胸腔，并用止血钳拉开老鼠胸腹腔； 4. 采集老鼠血液标本时切忌直接剪开股动脉放血，以免动脉血喷射造成污染和生物安全隐患，应用注射器刺破血管或心脏抽取； 5. 采集老鼠肺脏及其它标本时应更换经过灭菌的剪刀和镊子，至少保证每个老鼠独自使用一把剪刀和镊子，用过的剪刀和镊子不要在现场重复使用； 6. 所有标本均一式两份，一份自己检测用，另一份送省疾病预防控制中心复核用； 7. 现场采集标本时要带冰排，采集的标本要及时放入标本采样箱中4℃保存； 8. 老鼠采集完毕后要进行深埋或焚烧处理； 9. 血清采集后和老鼠标本一同放-80℃保存。 10. 用标本运输箱4℃条件下运输。 三、尿液标本前处理 1. 尿液标本仅适用于核酸检测； 2. 将30ml尿液用107000rmp离心2h，倒掉上清取沉淀物进行RNA提取（按照RNA提取试剂盒程序操作）。 四、标本的检测 1. 病例和健康人群血清抗体检测 免疫荧光（欧蒙） lgM捕捉法（德国IBL） 2. 核酸检测 ⑴ Real-time RT-PCR (北京硕士) ⑵ RT-PCR检测 RT-PCR检测选用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit进行检测。 反应体系：5× OneStep RT-PCR Buffer 5μl dNTP Mix 1μl Enzyme 1μl RNA 5μl HV-SFO (10μM) 1μl HV-SRO (10μM) 1μl H2O 11μl Total 25μl 反应条件： 50℃ 30 Min 94℃ 15 Min 94℃ 1 Min 50℃ 1 Min 35 cycles 72℃ 3 Min 72℃ 10 Min ⑶ 巢式PCR检测 巢式PCR 试剂选用 QIAGEN HotStarTaq Master Mix Kit. 反应体系： HotStarTaq Master Mix 12.5μl PCR Products 2μl SEO-SF/ HSF (10μM) 1μl SEO-SR/ HSR (10μM) 1μl H2O 8.5μl Total 25μl 反应条件： 94℃ 15 Min 94℃ 30 Sec 50℃ 30 Sec 30cycles 72℃ 40 Sec