实验十溶菌酶提取、分离、纯化及生物学性质、理化性质.doc

实验七 溶菌酶的制备及其性质 【实验目的】 同羧肽酶实验 【实验要求】 同羧肽酶实验 【实验内容】 1.溶菌酶Y活性检测 ⑴ 酶活力测定方法 ⑵ 酶活力单位定义 ⑶ 比活力定义 ⑷ 蛋白含量测定方法 2. 蛋清溶菌酶的提取 ⑴ 每组4～5个新鲜鸡蛋 ⑵ 利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取 3. 溶菌酶的分离、纯化 ⑴ 利用各种方法，从上述提取液分离 ⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测 ⑶ 分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性 4. 溶菌酶理化性质 ⑴ 溶菌酶的分子量测定 ⑵ 溶菌酶的等电点测定 5. 溶菌酶的酶学性质 ⑴ 在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km ⑵ 初步确定溶菌酶的最适pH ⑶ 初步确定溶菌酶的最适温度 ⑷ 提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型 ⑸ 提出溶菌酶的激活性并验证 (6) 溶菌酶的热稳定性 【实验原理】 溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。 　　溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。 溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。 【实验材料】 1.实验器材 循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL) 2．实验试剂 ⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋） ⑵ 底物微球菌粉 ⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂 ⑷ 固体氯化钠（NaCl）Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4） ⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮 (6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50 ⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸 ⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验二） ⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质 【实验操作】 1.蛋清的制备 将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml. 2.鸡蛋清粗分离 按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。 3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析 ⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。 ⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。