核酸的制备及基因组文库的构建.ppt

相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。 基因组、cDNA文库的构建流程 组织 可克隆之DNA 载体 DNA cDNA mRNA 部分酶解DNA DNA长度分级 双链cDNA DNA与载体连接 引入宿主细胞 鉴定文库的完备性 扩增后供长期储存 筛选出所需要的克隆 基因组DNA文库的构建简图 限制性内切酶 基因组DNA 基因重组 转化细菌 体外包装 基因组文库构建步骤 一、基因组DNA的提取 染色体DNA、 质粒DNA 二、基因组DNA的不完全酶切 1. 根据实验需要选择合适的限制性内切酶 当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们分别平均在每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096） 2. 分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb 3、克隆片段的大小与构建文库克隆子的关系 1975年，L. Clarke和J. Carbon提出了一种计算一个完全基因文库需要实际克隆数的公式。 文库实际克隆子数N＝　ｌｎ（１－ｐ） 　　　 　　　　　　　　　 ｌｎ（１－ｆ） 　　 ｆ＝　 DNA片段平均长度 　　　　　 　基因组ＤＮＡ的总长 要求：构建的基因组文库含目的DNA片段（基因）的几率（ｐ）99% 对于人?-珠蛋白基因（1.5kb）的例子，N值应是： ｌｎ（１－0.99） N = ｌｎ[1 -（ 1.5 ? 100 / 3?106 ）] = 9.2 ?106 　基因组大小－酶切片段大小－文库克隆子数的关系 基因文库的质量标准： 除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备： 克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 载体的装载量必须大于基因的长度； 含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 三、酶切片段与克隆载体连接 １、酶切片段的分离与纯化 　　１）低熔点琼脂糖回收目的片段 　　２）试剂盒回收目的片段 ２、酶切片段与克隆载体连接重要的是克隆载体的选择　　　　 除质粒(10 kb)、 ?噬菌体载体(20 kb )、粘粒(Cosmid) （ 40 kb ）外，还有酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome，YAC)（100-2000kb），细菌人工染色体（BAC)、噬菌体P1克隆系统以及哺乳动物人工染色体（MAC)等载体。 ’ 四、重组ＤＮＡ转化受体细胞 １、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞　　 ２、重组质粒转化受体细胞 1）转化法(transformation)：氯化钙处理的大肠杆菌很容易摄取外源性DNA，转化特指将质粒DNA 或以它为载体构建的重组子直接导入细菌细胞的过程。 2）转导法(transduction)：在分子克隆技术中，转导特指以噬菌体DNA 为载体，将外源DNA 导入细菌细胞的过程。 3）转染法(transfection)：转染特指“将外源基因导入哺乳动物细胞的一系列技术的通称”。哺乳动物细胞很难捕获外源DNA，近年来通过摸索已建立了几种高效的将外源基因导入哺乳动物细胞的方法，如脂质体包裹DNA 转染法、磷酸钙转染法、DEAE － 葡聚糖介导转染法、电击法等。 五、基因组文库克隆子的保存与筛选 １、基因文库的保存 1)影印滤膜保存法 该法需要两个滤膜，首先将无菌主滤膜平铺于培养基平板上，用一灭菌涂布棒将接种液均匀涂在主滤膜上，37°C培养过夜。然后将带有编号的影印滤膜放于带有细菌菌落的主滤膜上（菌落面朝上），将两张滤膜紧密的压在一起，并用针头沿每对硝酸纤维素膜边缘不对称地打孔使两张滤膜相对定位。剥离两张滤膜，温育影印滤膜，然后密封贮存。 2）文库在液体培养基中扩增保存 方法：从琼脂糖平板上刮取已长出的克隆子（不是单个）转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。 缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。 3)保存单个克