第二章.基因工程主要技术原-pcr技术第二章.基因工程主要技术原理-pcr技术第二章.基因工程主要技术原理-pcr技术第二章.基因工程主要技术原理-pcr技术.ppt

第三节 PCR技术原理 2.3.1 核酸体外扩增最早的设想 2.3.2 聚合酶链反应的发明 2.3.3 PCR 原理 2.3.4 PCR反应过程 2.3.5 PCR反应体系 引物 模 板 2.3.6 PCR的相关技术 逆转录PCR (retrotranscription PCR, RT PCR) 锚定PCR (anchored PCR) 反向PCR (inverse PCR,inPCR) 2.3.7 其它体外核酸扩增技术 2.3.8 PCR技术的应用 2.3.9 PCR技术未来发展的方向 回答问题 * 基因工程 * 基因工程 第二章 基因工程技术原理 PCR （polymerase chain reaction）是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA某个特殊区域的技术? 是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。 返回目录 返回第二章 　　由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人才发明了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 其原理类似于DNA的体内 复制。 开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段，由于该酶不耐热，因此，每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时，这一过程耗时，费力，且易出错。 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。 PCR具有划时代意义，Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金 基本原理：即DNA合成的基本原理 基本要素：teplate/primer/DNA poly Template:ssDNA or dsDNA Primers:oligo-nucleotides等 Substrates:dNTP DNA polymerase: Taq polymerase?使用的是来自高温微生物的DNA polymerase 5’ amplicon 3’ 3’ 5’ 94℃ 37℃ 72℃ Cycle 1 2分子 Cycle 2 4 分子 Cycle 3 8分子 ①变性。将模板DNA置于95℃的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA； ②退火。将反应体系的温度降低至55℃左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对； ③延伸。将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72℃，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。 如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。 denature dsDNA ssDNA 92-96℃? annealing 37-72℃ 50-58℃? extension 72℃ 94℃ 94℃2min 4℃+ 72℃2min 72℃2min 65℃1min 变性 退火 延伸 这三个热反应过程的重复称为一个循环 一般需使用一对引物 新合成的链又可作为模板 缓冲液 buffer（1×） 50 mM KCl 引物退火 10 mM Tris.HCl pH 8.3-9.0 1.5 mM MgCl2 (0.5-2.5) dNTP 终浓度0.2mM(即饱和浓度)（pH7.0） 4种dNTP应平衡，提高忠实性 使用时应考虑Mg2+，引物，产量之间的关系 如序列分析和制备探针时，用20-40μm ? 引物 各1μm，即1pmol/μl OD260 dsDNA 50μg/ml（molecular cloning） SsDNA 40μg/ml oligo 33μg/ml 长度至少16bp，通常20-30bp Tm=81.5-16.6log[J+]+0.041(G+C)%-(600/N) N：链长 J：单价离子浓度 若N=20 G+C%=55% [J+]=60mmol/L，则： Tm=81.5-20.3+22.