第三章免疫原和抗血清的制备.ppt.ppt

抗体特异性的鉴定：双向免疫扩散法 抗体效价的鉴定：凝集试验 、双向免疫扩散试验、ELISA 抗体纯度的鉴定：SDS、双向免疫扩散试验、免疫电泳 抗体亲合力的鉴定：平衡透析法、ELISA、RIA竞争结合试验 一、抗血清的鉴定 2℃～8℃保存：短期保存 冰冻保存：保存5年 真空干燥保存：保存5～10年 二、抗血清的保存 第五节 抗血清的纯化 抗原免疫动物制备的抗血清是成分复杂的混合物，除含有特异性抗体外，还存在与目的抗体不相关的成分。纯化目的是除去这些不相关成分，防止抗血清中其他杂抗体干扰试验结果。 *  第三章 免疫原和抗血清的制备 第一节 免疫原的制备 一、颗粒性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 三、半抗原性免疫原的制备 第二节 免疫佐剂 一、佐剂的种类 二、佐剂的作用机制 第三节 抗血清的制备 一、免疫动物的选择 二、免疫程序 三、动物采血法 第四节 抗血清的鉴定和保存 一、抗血清的鉴定 二、抗血清的保存 第五节 抗血清的纯化 一、特异性IgG抗体 二、单价特异性抗血清 思考题 小结 第一节 免疫原的制备 免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体并能与抗体发生反应的物质 颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫 可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸 细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵 一、颗粒性抗原的制备 组织细胞抗原的制备： 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨 （一）可溶性抗原的制备 二、可溶性抗原的制备和纯化 组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备： 反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化 超声破碎法－超声波（1～20kHz） 自溶法－自身酶系 酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴 免疫球蛋白片段的制备： 非共价键解离法－改变pH 、利用强变性剂 共价键解离法－氧化法和还原法 溴化氰裂解法 酶解法－木瓜酶 、胃蛋白酶 超速离心法： 差速离心法－低速和高速离心交替进行 密度梯度离心法－区带离心法 （二）可溶性抗原的纯化 选择性沉淀法： 核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋、链霉素 盐析法－硫酸铵、硫酸钠 有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮 聚合物沉淀法－聚乙二醇 离子交换层析法： 利用蛋白质带电荷不同进行分离 离子交换剂： 离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂 凝胶过滤法： 利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离 亲和层析法：利用生物大分子之间具有的专一性亲和力 (1)亲和层析支持物的选择： ①非特异性吸附低； ②液体流速快； ③在各种pH和高浓度盐溶液中稳定； ④有合适丰富的化学基团，与蛋白质或其它化合物结 合； ⑤有丰富的微孔，以增加结合容量。 最常用的支持物是Separose4B (2)配体的选择条件： ①抗原或抗体必须单一特异性； ②抗原与抗体必须具有较高的亲和力； ③配体必须有一个适当的化学基团。 (3)抗原或抗体与支持物的结合： ①活化：溴化氰； ②接“手臂”：带“手臂”琼脂糖有氨基琼脂糖、羧基琼脂糖、溴乙酰琼脂糖、重氮盐衍生物琼脂糖、疏基琼脂糖。 (4)亲和层析条件的选择： ①封闭活性基团：用无关蛋白质或三乙醇胺过柱； ②除去未结合和结合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脱，再用解脱剂处理； 解脱剂：3mol/L 硫氰酸钾（或钠）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸缓冲液 电泳法： 利用分子量和电荷量不同进行分离 （三）纯化抗原的鉴定 蛋白含量测定：紫外吸收法、双缩脲法、酚试剂法 分子量测定：SDS、凝胶过滤 纯度鉴定：醋酸纤维膜电泳、SDS、毛细管电泳、等电聚焦、高效液相层析 免疫活性鉴定：双向免疫扩散、免疫电泳、ELISA 三、半抗原性免疫原的制备 半抗原(hapten)：仅有抗原性而无免疫原性的物质如多肽、甾体激素、核苷、某些药物等 载体(carrier)：赋予半抗原以免疫原性的物质 ①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲状腺球蛋白 血蓝蛋白 ②多肽聚合物：多聚赖氨酸（polylysine） ③大分子聚合物：羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC) 　　　　 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP） （一）载体 ①物理方法：利用通过电荷和微孔吸附半抗原