第五章酶学分析技术.ppt

第五章 酶学分析技术 第一节 酶活性测定基本 知识 第二节 酶活性单位的 计算 第三节 酶活性的测定 第四节 代谢物的酶法 测定 第五节 同工酶测定 本章小结 二、影响酶活性测定的因素 （一）样品处理的影响 1. 溶血 RBC中某些酶活性比血高，如LDH高150倍，AST高15倍，ALT高7.5倍。 2. 抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA、草酸盐，可抑制需Ca2+的AMS和需Mg2+的CK、5NT、ALP等，所以，酶活性测定都用血清。 3. 样品存放时间，各种血清酶稳定性不同，如ACP、CK在室温下迅速失活，AMS、GGT则很稳定。 （二）测定条件的影响 1. 温度 温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius公式。另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。 k 速率常数 A 频率因子 Ea 表观活化能 （1）温度的选择 37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多物理化学实验数据在30℃完成，IFCC建议30℃作为参考方法的标准温度。 （2）温度系数 温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数（Q10）。Q10表示温度对反应速度影响的大小。 2. pH （1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合。 （2）改变酶活性中心必需基因的解离状态，影响酶活性。 （3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。 （4）使亚基解聚 3. 缓冲液性质 酶活性下仅受缓冲液pH影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。 （1）缓冲液中弱酸的解离数pka必须接近酶测定时的pH。如ALT测定pH7.4（磷酸pka6.7）LDH测定pH8.8，（二乙醇胺pka 8.8）ALP测定pH10（碳酸pka10.32）。 （2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH、ALP有抑制作用。 （3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏。 （4）缓冲液在可见光区或紫外区没有或仅有极低的光吸收现象。 三、工具酶 （一）工具酶的概念 作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。如: G+O2+H2O 葡萄糖酸+H2O2 H2O2 +4-AAP+酚 红色醌类化合物 又如： C～P+ADP C+ATP CK为待测酶 ATP+G G-6-P+ADP G-6-P+NADP+ 6-磷酸葡萄糖酸+NADPH GOD POD HK CK G6PD 酶学分析中使用的工具酶可以有一个以上，包括辅助酶，指示酶和待测酶，组成偶联反应。 A B C P Ex为待测酶，Ea为辅助酶，Ei为指示酶 在上述反应中CK为待测酶，HK为辅助酶，G6PD为指示酶 用于测定酶活性时，底物是过量的，而测定代谢物浓度时，酶是过量的。 Ex Ea Ei 常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。 （二）工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。 （三）常用工具酶及其指示反应 1. NAD(P)+或NAD(P) H偶联的脱氢酶及指示反应 最常用的工具酶有GLDH、G6PDH 、LDH、MDH，它们都以NAD(P)+或NAD(P) H为辅酶。NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm，荧光波长为460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。 如 ALT测定 工具酶是LDH 缺点： 1）需要紫外分光光度计