微藻分离及保存.doc

1用液体培养基分离培养的方法 用液体培养基培养分离的藻种首先要配制培养液,液体培养基通常用消毒海水按常规配方(例如F/2培养基)配制,或者根据不同的微藻采用其专用的培养基配方。分离和培养的工具、器皿要进行高温灭菌。 1.1样品系列稀释分离法 1.1.1原理 在无菌操作的条件下,对分离的样品采用逐步稀释的方法,边稀释,边在显微镜下镜检,直到视野中每滴样品只含1个细胞时,即停止稀释,开始分接培养。 1.1.2方法 首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品,其他试管中加入等量培养液,加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定(如10ml),从第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品(10mL)加到第二支试管中,充分振荡摇匀,此时藻液被稀释了2倍,再用一支新的消毒的移液管,吸取第二支试管中的稀释藻液(10mL)加入第三支试管中,如前振荡,使均匀稀释,此时藻液被稀释了4倍,以后的试管依次采用同样的方法稀释,直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞,可以用这样的稀释藻液进行培养,最终的稀释液种分装到不同的试管中,用棉塞塞好试管,把试管放在有漫射阳光的地方,每日轻轻摇动几次,发现试管中有藻色后进行镜检,如镜检到单种则表示分离成功,此时已达到了分离、纯化的目的,可进行扩大培养。 1.1.3应用概况 样品系列稀释分离法设备简单,操作简便,工作量小,但是这个技术有很大的盲目性,分离的样品很可能来自两个或更多的细胞,分离的微藻单种不一定是目标种,但可能分离到其他种或新种,尤其对于从天然水域采取水样的初步分离非常适合,而且对于微藻的种类、大小没有限制。 1.2微吸管分离法 1.2.1原理 在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴中只有目标单种为止。 1.2.2方法 在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时,用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞,放松手指,藻细胞被吸入微吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上,显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞,经过如此再反复操作,直至达到单种分离的目的。然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内,放在适宜的光照下培养,试管有藻色后镜检,培养为单种的试管,其他不合格的弃掉。 1.2.3应用 微吸管分离法的特点是易找到特定的种类,所用的设备也较简单,但操作技术难度较大,往往吸取一个单细胞需要几次至十几次才能成功,而且适于分离个体较大或丝状的藻类,如螺旋藻、骨条藻等,较小的藻类用此方法比较困难。 1.3水滴分离法 1.3.1原理 在无菌操作的条件下,把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大小合适的小水滴,镜检水滴中只有一个要分离的单种,即可冲入试管培养。 1.3.2方法 用小烧杯装稀释的藻样,将微吸管插入藻样中,提取微吸管,让多余的藻液滴出,然后把管口与消毒过的载玻片接触,即有一个小水滴留在载玻片上。一个载玻片滴3~4滴,间隔一定距离,然后在显微镜下观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞(无其他生物混杂),即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中,试管口塞上棉塞,放在适宜的条件下培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜(稀释至每个水滴约有1~2藻细胞),水滴大小适宜,以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜,并且观察要准确、迅速。 1.3.3应用 水滴分离法操作简便易行,但具体操作中要注意上面提到的问题。此方法对于藻细胞的大小没有限制,尤其适于分离已在培养液中占优势的种类。 2固体培养基分离方法(平板分离法) 作为微藻分离用的固体培养基,是在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂,并且使其溶解和高温高压灭菌后,通过适当的方法,把要分离的藻样接种在培养基上,通过一定的时间培养,在培养基上长出单个的藻落而达到分离的目的。 2.1固体培养基制备和灭菌 在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂(1.0%~2.0%),加热溶解后,分装到三角烧瓶中,置于高压蒸汽灭菌锅器中灭菌,温度121,时间20~30min,待培养基冷却到50℃时,无菌操作倒入到灭菌的培养皿中待用。 2.2接种的方法 接种在超净工作台上进行,接种的方法有两种。 2.2.1喷雾法 首先用消毒海水把要分离的藻样进行适当的稀释,装入消毒过的医用喉头喷雾器中,打开培养皿盖,把藻样喷射到培养基平面上,使藻样在培养基表面上形成分散均匀的一层薄水珠。水样稀释到合适的程度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔1cm以上有一个藻细胞,否则将来长出的藻落距离太近,不易分离。 2.2.2划线法 把接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第一次划线3~4条,把培养皿转动约70角,并把接种环在酒精灯上灭菌,通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次