第13章基因辩析.ppt

第十三章基因工程和分子生物学常用技术 Genetic Engineering and The Popular Technology In Molecular Biology 第1节 基因工程与基因重组 Genetic Engineering and recombination 一、基因工程的概念 基因工程是将各种来源（内、外）的原核、真核、天然或人工方法获得目的基因，在体外与载体基因重组后，导入适当的宿主细胞，DNA重组体随着细胞增殖而扩增，再通过基因表达得到大量目的基因片段（分子克隆，clone）的技术。 基因工程技术是把不同来源的目的基因和载体DNA分子重新组合，故亦称为重组DNA技术。 基因工程四要素 1.目的基因 2.工具酶 3.载体 4.受体细胞 重要的工具酶 （1）限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease） 1.限制性核酸内切酶概念、特点 识别DNA的特异序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸水解酶。是基因工程“分子刀”。 特点：*切割DNA多聚核苷酸链中磷酸二酯键 *具有回文结构特征 （2）DNA聚合酶（DNA polymerase） 以DNA为模板，dNTP为原料，RNA作引物，从引物的3’-末端或切口3’-末端沿5’→3’方向延长核苷酸链。该酶具有3’→5’或 5’→3’核酸外切酶活性。 基因工程主要应用E.coli DNA聚合酶Ⅰ、T4 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶等。 （3）DNA连接酶（DNA ligase） 1976年，科学家在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接来，修复好DNA链的断裂口。这种酶叫作DNA连接酶，是名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种 DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。 载体 能够携带外源DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。其化学本质是DNA。 易进入宿主细胞，并能在体内繁殖。 具有多克隆位点，易插入外源基因。 有可供选择的遗传标记，能够进行筛选。 易从宿主细胞中分离纯化。 常用载体：质粒、噬菌体、黏粒、病毒。 1.质粒(plasmid) 基因工程中最常见的载体。是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的环状双链DNA。 通常质粒的大小为2～300kb。 一般只能容纳10kb的外源DNA片断。 外源DNA片断越长，越难插入和稳定。 2.噬菌体(bacteriophage，phage) 寄生于细菌体内，并能溶解细菌细胞。 具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。 λ噬菌体两种生长途径（示意图） 3.黏粒(cosmid) 黏粒是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。 黏粒本身约4～ 6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。 4.病毒 病毒载体更多地用于真核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。 重组DNA技术的原理和工程 DNA重组包括下列五个过程。 1. 制备目的基因 2. 目的基因与载体的连接 3. 将外源DNA或重组体导入受体细胞。 4. 目的基因的筛选和鉴定。 5. 克隆基因的表达。 1.目的基因的制备 1）制备基因组DNA文库 使用相同载体的一组基因的克隆。所有被克隆的DNA分子能表示整个生物的基因组。 2）制备cDNA文库 （3）聚合酶链反应( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（25?30次），扩增目的基因。 （4）化学合成基因 2、 目的基因与载体的连接 ——基因工程的核心 （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2）平头末端连接 3）人工接头法 4）同源多聚尾连接法 3、重组DNA导入宿主细胞 转化：以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 感染：以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的