A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体.docVIP

A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体 　　摘 要：世界首个单克隆抗体 （Monoclonal antibody，简称单抗） 于1986 年， 获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中A蛋白（Protein A）层析介质的选择尤为重要，可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中A蛋白亲和层析的相关内容。 　　关键词：A蛋白；耐碱性；动态载量 　　全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单 抗 药 物 主要是 由 中 国 仓 鼠 卵 巢 细 胞 （Chinese hamster ovary cell，简称 CHO 细胞） 表达产生，由 CHO 细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/L，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。 　　根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯 （样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用A蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但A蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，A蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此，蛋白 A 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。 　　1 A蛋白的性质金黄色葡萄球菌 　　A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区域结合。天然的A蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的SPA 54KD，去掉与细胞壁结合部分的SPA 42KD。SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。近几年来基因工程的SPA出现，解决了天然A蛋白的耐碱性问题，MabSelect Sure是基因工程的SPA，去掉了天然SPA的DACE 区域，对于B区域进行了修饰，将不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修饰后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH；这就很好的解决了层析介质CIP的问题，同时修饰后的SPA也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对SPA的作用，使洗脱收集液中SPA的脱落更低。 　　2 结合单抗的A蛋白层析介质的选择 　　在A蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是HCP和基因组DNA；由于A蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱pH，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有A蛋白（配基）的脱落。在A蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基A蛋白，以及A蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是protein A的脱落原因，所以选择A蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。 　　2.1 A蛋白层析介质相关指标 　　耐碱性：药物GMP生产最基本的要求是无菌、无热源。NaOH 是最好的除菌、出热源的试剂。同时NaOH也是公认的CIP试剂，使用NaOH 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；?郧?NaoH的成本低。NaOH是公认的CIP试剂，实验表明，NaOH的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（CPG）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。CPG填料在高pH下不稳定，不适合用NaOH清洗。传统的A蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，?郧以谂渲檬迸ǘ冉细撸?这对生产是一个瓶颈。 　　GE公司的MabSelect Sure 系列是通过基因工程修饰的A蛋白介质，去除了不耐受NaOH的氨基酸，提高了层析介质耐受NaOH的能力。同时 MabSelect Sure LX是必威体育精装版的A蛋白层析介质，结合了耐碱和高载量的性质。另外， Mabselect Sure和Mabselect Sure LX介质在NaoH清洗后寿命可以在300次以上。使用不同浓度的NaOH 清洗Mabselect Sure 的使用次数。随着抗体技术的发展，培养条件改善以及表达量的大幅度提高（生产规模已经到达3-5g/L），