D―乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究.docVIP

D―乳酸大肠杆菌工程菌的驯化及其补料发酵研究 　　摘要：以前期构建的D-乳酸大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌LHY02为出发菌株，通过在乳酸盐中对菌株进行驯化的方式来解除乳酸根对菌体的抑制作用；采用葡萄糖分批补加方式缓解高含量葡萄糖的阻遏效应，拟进一步提高大肠杆菌发酵产D-乳酸的产量、生产强度和糖酸转化率。结果表明，驯化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖发酵中D-乳酸产量比驯化前提高了36.7%。LHY201结合葡萄糖进行补料发酵（补料方式为8%+8%+4%），乳酸产量、发酵时间、糖酸转化率以及生产强度分别为185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h，D-乳酸光学纯度达到99.6%，相比一次性添加20%葡萄糖的分批发酵，乳酸产量和糖酸转化率分别提高了21.1%和21.2%，发酵周期缩短了一半。 　　关键词：大肠杆菌工程菌；D-乳酸；驯化；补料发酵 　　中图分类号：Q533+.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4771-05 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.035 　　D-乳酸作为一种重要的手性中间体，是合成多种手性物质的前体，在医药、农药、化工及耐热型聚乳酸合成材料等方面的应用十分广泛，其生产具有重要的实用价值。但相对于L-乳酸发酵生产而言，D-乳酸尚未实现大规模的生产和应用[1]。目前已有一些菌株能较高产量生产D-乳酸，如芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp. CASD）经过发酵花生粕，D-乳酸产量高达207 g/L[2]；经过工程改造的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）能利用甘油产142.1 g/L的D-乳酸，原料转化率达到0.82 g/g[3]；同样经过工程改造的嗜碱芽孢杆菌产量可达143.99 g/L且生产强度可达3.04 g/L/h[4]；棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）配合同步糖化工艺发酵新鲜的甜土豆，产量达到186.40 g/L，生产强度保持在 2.55～3.11 g/L/h[5]。 　　大肠杆菌具有遗传背景清楚、营养要求低等优点，在D-乳酸发酵中也引起了越来越多学者的重视。借助基因敲除手段配合两阶段发酵工艺，大肠杆菌Escherichia coli B0013-050B能产111.9 g/L高纯度的D-乳酸[6]；选用为Ca（OH）2为发酵中和剂，大肠杆菌Escherichia coli ALS974能产138 g/L 的D-乳酸，生产强度高达6.3 g/L/h[7]；而课题组前期构建的一株出发菌株为Escherichia coli W的工程菌Escherichia coli HBUT-D，在6 t的发酵规模下，采用中途一次补料的方式，能产126 g/L D-乳酸，生产强度高达6 g/L/h[1]。总体来看，这些菌株发酵生产强度都较高，但大肠杆菌发酵D-乳酸的产量仍相对较低。 　　进一步提高大肠杆菌D-乳酸发酵产量，需更多的发酵原料，但微生物在发酵过程往往受到发酵原料中葡萄糖的阻遏及产物的抑制，继续提高发酵原料中的葡萄糖含量会造成发酵残糖过高，限制了D-乳酸产量的提升[1]；而且从前期的研究中还意识到，随着乳酸产物在发酵过程中的不断增加，产物乳酸根对发酵的抑制现象将会更明显[8]。 　　因此本研究拟以前期构建的工程菌Escherichia coli LHY02为研究出发菌株，通过在不同浓度的乳酸盐对菌株进行驯化，提高其对乳酸盐的耐受性，同时通过分批补料的发酵方式缓解高浓度葡萄糖的阻遏效应，最终达到进一步提高大肠杆菌D-乳酸的发酵产量、生产强度及糖酸转化率的目的。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株 试验所采用大肠杆菌E.coli LHY02（ΔfocA-pflB ΔfrdABCD ΔadhE ΔackA：pflBp6-acEF-lpd）由本实验室构建，能高效利用葡萄糖或木糖发酵产D-乳酸，在无氧条件下生长良好，保存在-80 ℃甘油管中。 　　1.1.2 培养基 　　1）LB平板培养基（g/L）。蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠5，琼脂20，121 ℃灭菌20 min。 　　2）乳酸钠驯化培养基。参照文献[9]配置NBS培养基，按试验设计添加0～14%的乳酸钠和20 g/L的葡萄糖（单独灭菌，灭菌条件为115 ℃灭菌30 min）。 　　3）发酵种子培养基。配置NBS培养基并灭菌，葡萄糖（20 g/L）单独灭菌后加入NBS培养基。 　　4）发酵培养基。3 L NBS培养基，按试验需求分别添加一定量的葡萄糖。 　　1.2 方法 　　1.2.1 LHY