GOX―CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究.docVIP

GOX―CP4EPSP转化甘蓝型油菜的抗草甘膦研究 　　摘要：利用Genome walking方法在孟山都抗农达油菜（Brassica napus L.）中克隆了GOX-CP4EPSP双顺反子结构。利用农杆菌介导的遗传转化方法将PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物双元表达载体转化甘蓝型油菜PolCMS恢复系“7-5”获得转基因植株。在田间对转基因植株喷施400倍的农达（41%草甘膦异丙胺盐），所有的转基因家系都能存活，而非转基因PolCMS恢复系“7-5”全部死亡。在转基因植株叶片中能够检测到GOX和CP4EPSP基因的表达。对转基因T1代3个家系在60 mg/L草甘膦培养基上的发芽试验以及GUS染色分析表明抗草甘膦的单株能表达与GOX-CP4EPSP共转化的GUS蛋白质，而对草甘膦敏感的单株和野生型对照植株都不能表达GUS蛋白质。鉴于GOX-CP4EPSP双顺反子在转基因油菜中的有效性和稳定性，可以作为双子叶植物遗传转化的筛选标记。 　　关键词：油菜（Brassica napus L.）；GOX-CP4EPSP；双顺反子；草甘膦抗性；农达；筛选标记 　　中图分类号：S482.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）10-2661-06 　　DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.10.053 　　Abstract： GOX-CP4EPSP Two-Cistron structure from Monsanto Roundup resistant Brassica napus L. was cloned by Genome walking Transgenic PolCMS restore line “7-5” with plant binary transformation vector PCAMBIA-GOX-CP4EPSP survived better under 400 time diluted solution with commercial glyphosate-containing 41% herbicide， while non-transgenic plants“7-5” died sprayed with the same diluted solution. In transgenic plants leaves， GOX and CP4EPSP stably expressed. Three transgenic T1 plant lines germination and growth in 60 mg/L glyphosate medium and GUS staining detection indicate glyphosate resistant plants show stable GUS expression， however glyphosate sensitive plants have no GUS activity assessed histochemically in X-Gluc solution. Due to the efficiency in transgenic Brassica napus L.， the use of GOX-CP4EPSP structure as a selectable marker provides an effective and alternative transformation selection system for dicot species. 　　Key words： Brassica napus L.； GOX-CP4EPSP； two-cistron； glyphosate resistance； roundup； selective marker 　　草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，Glyphosate）是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂。1974年草甘膦作为除草剂在美国登记注册之后，孟山都公司推出了草甘膦异丙胺盐将其投放市场，商品名为农达（Roundup）[1]。目前，草甘膦是世界上应用最为广泛的农药品种[2-5]。 　　草甘膦被植物迅速吸收后随着同化产物输导到植物的整个器官中，对植物细胞分裂、叶绿素合成以及光合作用过程中的蛋白质代谢有着重要影响并导致植物死亡。根据草甘膦的抑制作用原理[6，7]，能使植物具有草甘膦抗性的方法有过量表达植物内源EPSP合酶；降解或者修饰解除草甘膦的抑制作用；在植物中转化并表达外源EPSP合酶[8]。在细菌中，EPSPs是由aroA基因所编码，大量抗草甘膦的aroA基因已被克隆，但只有少