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IPS细胞定向分化为造血干细胞关键技术的研究进展 　　摘要：本文研究了诱导多能干细胞（IPS）分化为造血干细胞的能力。用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类IPS共培养，将IPS分化为造血干细胞，用流式细胞术检测造血干细胞表面标志物的表达水平，实时荧光定量检测分化过程中IPS与造血干细胞的基因表达水平的变化，用免疫磁珠法分离CD34+造血干细胞检测细胞的集落形成能力。结果显示：IPS与OP9细胞共培养诱导造血分化第四天IPS发生了变化，分化得到造血干细胞的表面标志物CD34。分化过程中多能性标志基因Oct4表达下降，造血转录因子表达升高，CD34的表达量逐渐升高，集落培养14天后得到红系集落、粒系集落、巨核系集落等。从而得到结论通过将IPS细胞与OP9细胞共培养，可诱导IPS细胞分化为造血干细胞。 　　关键词：IPS细胞；分化；造血干细胞 　　0 引言 　　目前，临床上普遍使用造血干细胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植，则需要进行人体的白细胞抗原配型，否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱，但数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞（IPS）提取技术的出现，使分化自身细胞变为了现实，不但避免了伦理问题，解决了免疫排斥问题，造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下： 　　1 材料和方法 　　1.1细胞株的来源 　　小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。 　　1.2试剂和仪器 　　小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。 　　1.3方法 　　在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。 　　OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。 　　免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和 CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。 　　用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。 　　集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。 　　2 结果 　　2.1细胞培养与观察 　　观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。 　　2.2诱导造血干细胞分化 　　通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。 　　2.3流式细胞术检测