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一个猪场高致病性PRRSV的分离鉴定 　　摘 要：本研究对一个猪场高致病性PRRSV疑似病例进行了病理剖检、PRRSV N蛋白基因RT-PCR扩增以及序列测定和分析。结果表明，N2号分离株N蛋白核苷酸序列与高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均为99.1%，N3/N4号与高致病性毒株的一致性均为98.9%，由此判定该猪场病猪感染毒株为高致病性PRRSV。该研究结果可为养猪生产中高致病性PRRSV感染的判断提供借鉴。 　　关键词：病理解剖；PRRS；高致病性PRRSV；RT-PCR；序列测定 　　中图分类号：S858.285.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0129-04 　　Abstract The suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm were conducted autopsy， the gene sequence of N-protein of PRRSV was amplified by RT-PCR， and then its sequence was determined and analyzed. The identity of the nucleotide sequence of N-protein was 99.1% between the isolate N2 and the highly pathogenic strains （JXA1， HuN4， SX-1 and TJM）， and that of isolate N3/N4 was 98.9% with the highly pathogenic strains. The results showed that the infected virus was highly pathogenic PRRSV in the pig farm. This research provided a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infection in swine production. 　　Keywords Pathological anatomy； PRRS； Highly pathogenic PRRSV； RT-PCR； Sequencing 　　猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）俗称猪蓝耳病，由动脉炎病毒科猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起，是一种急性病毒性传染病[1，2]。高致病性PRRSV是我国现阶段猪蓝耳病流行的主导毒株，对猪呼吸系统、繁殖系统、神经系统、免疫系统、消化系统均有强的致病力，有很多猪场因为感染该病遭到毁灭性打击[3-8]。2016年6月份，某自繁自养的猪场发生疫情，该猪场的哺乳仔猪陆续发病，出现眼睑水肿、发热、食欲减退、皮肤发红、呼吸急促等现象，有的可见咳嗽、腹泻、震颤等症状，发病率达到80%，死亡率达到50%以上，使用黄芪多糖、抗生素等治疗效果均不明显。 　　为了对该猪场病情进行确诊，以便对症治疗，本研究对疑似病例进行病理解剖、RT-PCR扩增及序列测定和分析，以期对PRRSV毒株做出准确判断， 为及时采取有效的控制措施、提高猪的成活率提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 样品采集 　　对4例病死猪进行解剖，观察病理变化。分别采集各病猪的肾、脾、肺、淋巴结组织各少许，-20℃低温保存备用。 　　1.2 材料和试剂 　　PRRSV阳性对照由本实验室保存；RT-PCR一步法试剂盒、DL2000 DNA Marker、凝胶回收试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；PTC-2000型PCR仪购自美国MJ Research公司。 　　1.3 引物设计与合成 　　根据PRRSV N蛋白基因序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为正向引物F：5′-ATGCCAAATAACAACGG-3′；反向引物R：5′-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3′。引物的扩增片段大小为369 bp。 　　1.4 样品处理与RNA提取 　　样品RNA的提取参照文献[9]，试验操作均在冰盒上完成，所用枪头、离心管均为RNase-free。取约2 g病料加入适量灭菌的PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）进行研磨，研磨后反复冻融3次，4℃、5 000 r/min离心2 min；取250 μL上清加入750 μL Trizol和200 μL氯仿，振荡混匀，-20℃静置5 min，4℃、12 000 r/min离心15 min；取500 μL上清加入等量的异丙醇，