一株耐镉假单胞杆菌的分离鉴定及其对镉的吸附研究.docVIP

一株耐镉假单胞杆菌的分离鉴定及其对镉的吸附研究 　　摘要：从污染水域筛选获得了1株可在含有100 mg/L Cd2+的培养基上生长的耐镉菌株Cd-t1。通过形态观察、16S rDNA扩增及系统发育分析，将其初步鉴定为嗜碱性假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila）。不同Cd2+浓度处理下菌株的生长曲线显示，各浓度Cd2+处理延缓了该菌株的生长时期。进一步利用扫描电镜、能谱分析与质粒消除试验发现，该菌株的Cd2+耐受性与其形态适应性变化和C、N、O、P、Na、K、Ca等元素含量的改变相关，并决定于质粒上的镉耐受基因。 　　关键词：镉污染；假单胞杆菌；16S rDNA；能谱分析；扫描电子显微镜 　　中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）11-2765-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.014 　　有色金属采选和冶炼、镉化合物工业、电池制造业等排放的含镉废水使中国部分地区耕地土壤受到不同程度的镉污染[1，2]，而这些土壤中的镉会通过食物链向人类转移并在肝脏蓄积[3，4]。镉在与含巯基、羟基的蛋白质分子结合后，会通过血液循环转移到肾脏，引起肝、肾等内脏器官及血液循环系统损伤，并致癌和致突变[5，6]。因此，镉污染的治理和修复具有十分重要的现实意义。但是，用于重金属污染治理的传统物理和化学方法费用高、能耗大，并易造成二次污染。而生物修复法作为新兴的重金属修复技术备受关注。其中，微生物特别是细菌以其数量众多、代谢活动旺盛在重金属的生物吸附中具有较好的应用前景[7]。 　　本研究从镉污染水域中分离获得1株耐镉菌株Cd-t1，在利用形态观察结合16S rDNA序列分析了其系统发育地位后，对不同Cd2+浓度处理下的菌株生长状况、形态特征及元素的积累状况进行了检测和观察，并对镉耐受基因进行了初步的定位，以期为进一步的基因克隆及构建高效耐镉菌株奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 菌株的筛选 　　试验水样于2011年8月取自渭河杨凌段。样品接种于含30 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨固体培养基上（牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.5%，琼脂粉2%，pH 7.2），以平板划线法分离菌株，培养获得单菌落。将其命名为Cd-t1，并接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上保存、备用。 　　1.2 菌株的16S rDNA鉴定 　　依据文献[8]提取菌株Cd-t1的基因组DNA，利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行16S rDNA扩增，引物由Takara公司合成。使用TaKaRa premix TaqTM扩增目的片段，PCR反应体系（50 μL）为：PCR Premix 25 μL，上下游引物（10 pmol）各0.5 μL，模板（300 ng/μL）1 μL，16S-free H2O 23 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共进行30个循环；72 ℃延伸5 min。反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统照相。 　　PCR产物送Takara公司测序，测序结果在NCBI上进行BLAST分析，并利用MEGA 4.0构建系统发育树。 　　1.3 不同镉浓度处理下菌株的生长曲线 　　挑取Cd-t1单菌落在分别含有0、10、20、30、40、50 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨液体培养基中于28 ℃、180 r/min振荡培养72 h。期间，每2 h取样并在600 nm下测定吸光度，检测细菌生长状况。每种处理3个重复，计算平均值。 　　1.4 菌株的扫描电镜观察 　　菌株Cd-t1在分别含有0、20、40、60、80、100 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨固体培养基上过夜培养后，参考郭瑞军等[9]的方法，挑取单菌落进行扫描电镜样品制备。样品经2.5%戊二醛固定4 h后，经0.1 mol/L PBS（pH 7.2）洗涤3次（每次10 min），梯度浓度乙醇50%-70%-83%-95%-100%干燥（每级15 min，其中无水乙醇干燥两次），乙酸异戊酯置换10 min后，用CO2临界点干燥仪干燥、喷金，并在场发射扫描电子显微镜（Hitachi S-4800）下观察菌体形态和照相。 　　1.5 菌株的能谱分析 　　利用X射线能谱分析仪（EDAX GENESIS XM2 SYSTEM 60x）对菌株Cd-t1微区进行能谱分析，检测C、N、O、Na、Mg、Al、Si、P、Pt、Cd、K、Ca元素相对含量（