一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立.docVIP

一种从羊奶中检测牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR方法的建立 　　摘要：羊奶制品因其良好的营养功效备受消费者的青睐，也是乳制品主要掺假对象。本研究参考市场可能掺假现状，分别根据羊和牛线粒体基因组16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，设计一对牛和羊特异性引物、一对大豆特异性引物以及相应的TaqMan-MGB 探针，建立羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测方法，并引入内标质控有效保证检测体系的准确性。本检测体系对羊奶、牛奶及豆浆的基因组DNA检测敏感度为0.01 ng；对羊奶中掺入牛奶和豆浆的体积掺假检测灵敏度均为0.1%。因此，本研究建立的羊奶中牛奶和大豆成分多重实时荧光定量PCR检测体系具有通量大、灵敏度高、特异性好等优点，实现了对羊奶中其他源性成分快速、准确的检测，对保障相关产品市场安全具有重要意义。 　　关键词：羊奶；牛奶；豆浆；多重实时荧光定量PCR 　　中图分类号：S879.1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0118-06 　　由于羊奶中含有的维生素和微量元素均高于牛奶，并且含有大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白结构成分与母乳基本相同，被营养学界称之为“奶中之王”[1]。羊奶中不含引起人体过敏的异性蛋白，尤其适合胃肠较弱、体质较差的婴幼儿饮用，但市场上的羊奶品质参差不齐。随着消费者认可度的不断提高，在利益的驱动下，在羊奶中掺入牛奶或者豆浆的现象非常普遍，掺假手段多种多样，不断变换，仅靠感官鉴评和传统的试验方法已不能满足市场需要[2]，严重影响我国奶业的健康发展。 　　目前，用于检测羊奶掺假的方法主要有气象色谱、液相色谱、电泳、PCR、ELISA和近红外光谱法等[3～6]。实时荧光定量PCR方法是以DNA为基础的一种检测技术，不受掺假形式的影响，可以进行快速、批量、自动、实时检测分析，具有灵敏度高、准确性好等优点，已经在动物源性成分检测项目上逐步取代一般PCR方法成为最常用的分子生物学检测手段[7]。为了保障羊乳及其产品品质，确保消费者的利益，建立准确检测牛羊乳及豆浆混掺的技术越来越重要。本试验旨在利用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，建立一种快速、准确检测羊奶中是否掺有牛奶和豆浆的方法。 　　1材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　1.1.1试验材料试验所用标准液态牛奶、液态羊奶取自山东省畜牧研究所奶牛及山羊养殖基地，液态豆浆是本实验室用大豆加工而成。市售样品为购自济南市大、中、小型超市的不同品牌奶制品。 　　1.1.2主要试剂与仪器试剂：Chelex-100（天根生化科技有限公司，北京）、蛋白酶K（TaKaRa，日本）、核算定量检测试剂盒（TaKaRa，日本）。 　　仪器：ABI7500实时荧光定量PCR仪（ABI，美国）、高速冷冻离心机（Eppendorf，德国）、Nanodrop 核酸蛋白含量测定仪（Eppendorf，德国）。 　　1.2试验方法 　　1.2.1样品基因组DNA的提取分别取牛奶、羊奶、豆浆液体样品2 mL加入2 mL无菌离心管中，2 500 r/min、4℃恒温离心30 min，弃上清液保留沉淀；向离心管中加入1 mL无菌磷酸钾缓冲液（pH 7.4），轻轻混匀后转移至1.5 mL离心管中，3 500 r/min室温离心10 min，弃上清；向沉淀中分别加入280 μL 5%Chelex-100和20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，56℃孵育30 min，漩涡震荡10 s混合均匀，100℃煮沸8 min，13 000 r/min离心3 min；将上清加入吸附柱中13 000 r/min离心1 min收集液体；向收集液中加入20 μL GlassMilk 和600 μL gDNA Binding Buffer充分混匀，65℃水浴15 min（其间不断轻柔地上下翻转离心管），室温放置5 min（其间不断轻柔上下翻转离心管）；4 000 r/min离心1 min，弃上清；向离心管中加入500 μL 70%乙醇，8 000 r/min离心1 min，弃上清，重复2次；加入500 μL无水乙醇轻轻混匀，8 000 r/min离心1 min，弃上清；8 000 r/min离心30 s，用10 μL枪头吸走残余液体，室温放置至彻底干燥；加入100 μL TE（pH 7.0）70℃水浴5 min，瞬间离心，转移上清液至新的离心管中-20℃保存备用。使用Nanodrop 核酸蛋白含量测定仪测定核酸浓度。 　　1.2.2引物及探针设计分别参照牛、山羊和绵羊线粒体基因组中高度保守的16S rRNA基因序列和大豆的KTi-S基因（GI：510514）序列，用Primer Premier 5.0设计牛奶、羊奶通