丝氨酸羟甲基转移酶活性测定及酶学性质研究.docVIP

丝氨酸羟甲基转移酶活性测定及酶学性质研究 　　摘要：通过测定苯甲醛在279 nm处的吸光度来确定丝氨酸羟甲基转移酶的活性，利用单因素试验分析Escherichia coli SRZ018菌株最适产丝氨酸羟甲基转移酶的条件。结果表明，最适产酶条件为pH 8.0，反应温度50℃，CTAB为0.03 g/L，DL-β-苯基丝氨酸浓度为200 μmol/L，PLP浓度为50 μmol/L，该条件下丝氨酸羟甲基转移酶的活性最高达到0.881 U/mg。 　　关键词：丝氨酸羟甲基转移酶：单因素分析；DL-β-苯基丝氨酸：L-丝氨酸；Escherichia coli SRZ018 　　L-丝氨酸属于非必需氨基酸，可用于合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱等前体。作为中间体，可用于合成L-色氨酸、L-多巴等。在医药、食品等领域均有较为广泛的应用。目前，生产丝氨酸的方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、生物发酵法和酶法，酶法以其反应过程简单、催化专一性强、反应条件温和及转化效率高等优点，受到国内外的普遍重视。近年来随着固定化酶和固定化细胞技术在氨基酸工业上的应用，使酶法成为生产L-丝氨酸的研究热点。 　　丝氨酸羟甲基转移酶（Serine Hydroxymethyltransferase，SHMT）是L-丝氨酸合成中的关键酶，催化甘氨酸和L-丝氨酸的相互转化。在丝氨酸羟甲基转移酶作用下，以5-磷酸吡哆醛作为辅酶，甘氨酸与N5，N10-亚甲基四氢叶酸反应生成L-丝氨酸。研究发现以甘氨酸为底物酶法生产L-丝氨酸时，菌体积累L-丝氨酸的含量与菌体含有的SHMT活性直接相关，SHMT活性越高，菌体产生的L-丝氨酸就越多，因此，获得高活力的SHMT是提高L-丝氨酸产量的关键。本试验根据已有的报道建立了一种快速、简易的SHMT测定方法，通过单因素试验优化产酶条件，提高酶活力，以期达到间接提高菌株由甘氨酸转化为L-丝氨酸的能力。 　　1.材料与方法 　　1.1菌株来源 　　E.coli-SRZ018菌株由华中科技大学生命科学与技术学院保藏。 　　1.2培养基 　　种子培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl10g/L。 　　发酵培养基：玉米浆51.96 g/L，磷酸氢二钾5.88 g/L，甘油13.60g/L，谷氨酸钠5g/L，MgSO40.8 g/L，蛋白胨5g/L，脯氨酸0.5 g/L，维生素B6 0.5g/L。 　　1.3其他试剂 　　DL-B-苯基丝氨酸购自Biosharp公司，磷酸吡哆醛（PLP）、氢氧化钠、氨苄青霉素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和十六烷基三甲基溴化铵（cTAB）均购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯。 　　1.4方法 　　1.4.1菌种活化与培养 菌株培养的种子培养基为LB培养基，种子培养基和发酵培养基的装液量均为30 mL，250 mL三角瓶，121℃灭菌20 min，冷却至室温，分别加入氨苄青霉素，终浓度达到100μg/mL，混合均匀。将保存的冻干管菌种接种至LB平板活化，活化好的菌株按照5%的浓度接种至种子培养基，37℃条件下200 r/min振荡培养4.5 h，转接至发酵培养基，37℃条件下180 r/min振荡培养14 h。 　　1.4.2酶活测定 逆向酶活是丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）活力的主要评价指标，逆向酶活的测定原理：SHMT可以催化DL-B-苯基丝氨酸分解产生苯甲醛，苯甲醛在279 nm处有最大吸收峰，因此可通过检测酶反应液在279 nm处的吸光度计算SHMT酶活。 　　1）苯甲醛标准曲线的绘制：精确配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmoL/L的苯甲醛标准溶液，于紫外分光光度计279 nm处测定其吸光度，根据吸光度Az79m（y）和浓度（x）的关系绘图，得到苯甲醛标准溶液的线性范围、回归方程以及相关系数。 　　2）SHMT逆向酶活的测定：取一定量发酵液于5 000 r/min离心10 min，去除上清液，加入适量的去离子水洗涤菌体1～2次，去除上清液，加入配制好的底物1 mL，振荡混合均匀，于30℃水浴反应1 h，反应结束将反应液8 000 r/min离心5 min，取上清液稀释至合适浓度后测定A279，以去离子水稀释底物相同倍数的溶液为对照，根据苯甲醛标准曲线计算SHMT逆向酶活。 　　1.4.3E.coli-SRZ018产SHMT条件的优化 以酶反应液的各组分为基础进行单因素水平研究，以磷酸缓冲液控制反应体系的pH，每个条件重复3次，研究DL-β-苯基丝氨酸、PLP、pH、CTAB、温度等因素对E.coli-SRZ018生产SHMT活性的影响。 　　1）CTAB对SHMT活性的影响。取相同量的菌体，依次加入CTAB的浓度为0.01、0.02、0.03、0