中学生开展DNA“细”提取的实践初探.docVIP

中学生开展DNA“细”提取的实践初探 　　摘 要 以鲫鱼的肌肉、卵和鳃的新鲜冷冻样品为实验材料，比较用传统方法和试剂盒法提取DNA的浓度和纯度。结果表明：从以上三种动物不同样品组织中均能提取到比较纯净完整的基因组DNA（A260/A280在1.8～2.0之间），而且从鱼卵、鱼鳃中提取的全基因组DNA浓度优于肌肉，能够更好的适用于后续的分子生物学试验研究。传统提取法DNA含量显著高于试剂盒法。 　　关键词 动物 基因组DNA 提取 　　中图分类号 Q-331 文献标志码 B 　　1 问题的提出 　　在苏教版生物必修2教材中安排了“DNA粗提取和鉴定”实验，以此加深学生对DNA这种细胞内重要有机物的了解。通过鸡血或香蕉细胞中DNA的粗提取实践，提取到了较多的絮状物。但对絮状物中DNA的含量是多少，老师并为对此做出讲解，由此激发了我们继续的探究欲望，因此继续进行DNA的细提取和DNA纯度检测实验。 　　2 问题的解决 　　天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，把P（蛋白质）除去，再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等，从中分离出DNA。制备高纯度的DNA溶液是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200 kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验（如PCR）打下基础。由于DNA分子在生物体内的分布和含量不同，要选择合适的材料和方法提取DNA。DNA的提取方法有多种，比如SDS-蛋白酶K消化法、CTAB法和试剂盒法等。 　　2.1 实验准备 　　实验材料：鲫鱼（三种组织：鱼卵、鳃、肌肉） 　　实验方法：传统方法和试剂盒法 　　实验目的：筛选出选取哪一种组织和方法更适合在中学中开展DNA的细提取实验。 　　2.2 实验试剂 　　DNA提取试剂：ACL细胞裂解液；蛋白酶K；酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；Tris饱和酚；无水乙醇；体积分数为75%的乙醇溶液；双蒸水。 　　细胞/组织基因DNA提取试剂盒（离心柱型，#GK0122）。 　　2.3 实验仪器 　　分析天平；高速离心机（H1202转头）；微量移液器；恒温水浴锅；高压蒸汽灭菌锅；纯水仪。 　　超微量DNA分析仪：2000C分光光度计。 　　2.4 实验操作 　　2.4.1 传统方法 　　（1） 取动物组织（如鱼的肌肉）约0.15 g于1.5 mL离心管中。 　　（2） 加入400 μL的ACL细胞裂解液，将组织剪碎成末，加入蛋白酶K 15 μL，置于55℃水浴消化4 h左右。 　　（3） 加等体积的Tris-饱和酚（500 μL），混匀4-5 min，12 000 rpm离心5 min（室温）。 　　（4） 取上清，放入新1.5 mL离心管中，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混匀2 min，12 000 rpm离心5 min。 　　（5） 取上清，放入2.0 mL离心管中，加2倍体积的-20 ℃无水乙醇，充分混匀后，-20 ℃放置2 h。 　　（6） 12 000 rpm离心10 min，弃去上清液（缓慢倒掉即可）。 　　（7） 加入1 mL 75%的乙醇，洗涤1次，12 000 rpm离心2 min，弃乙醇（缓慢倒掉即可）。 　　（8） 将离心管倒置干燥30 min。 　　（9） 加100 μL的双蒸水溶解DNA，轻弹管壁，65℃温浴30 min。 　　2.4.2 试剂盒法（详见试剂盒操作说明书） 　　2.4.3 DNA的浓度和纯度检测 　　DNA的纯度由260 nm和280 nm处的光吸收（即A260/A280）的比值决定。取DNA溶液1μL，用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度，每个样品重复测定3次。 　　2.5 实验结果 　　DNA用无菌水溶解后在2000C分光光度计上测上述实验提取到的DNA纯度和浓度。结果如表1所示。 　　从表1数据可以看出，从以上三种动物不同样品组织中均能提取到比较纯净完整的基因组DNA（A260/A280在1.8～2.00之间），而且从鱼卵、鱼鳃中提取的全基因组DNA浓度优于肌肉，能够较好地适用于后续的分子生物学试验研究。 　　2.6 实验结论 　　（1） 实验所提取到的全基因组DNA包括线粒体中的DNA和细胞核中的DNA。由于鱼卵的细胞小于体细胞，因此同样重量的鱼卵中所含的细胞个数高于鱼肉细胞的个数，再加上鱼卵细胞要不断分裂和生长需要消耗较多的能量，因此全基因组DNA的含量高于肌肉细胞。 　　实验结果显示从鱼鳃中提取的全基因组DNA含量高于鱼肉细胞。查阅资料后推测鳃是鱼类的呼吸器官，同时还具有排泄氮代谢废物和参与